组织工程心脏瓣膜支架材料研究进展

　　作者：刘兴光　汪钢      作者单位:710032陕西西安第四军医大学西京医院心脏外科

　　【摘要】 心脏瓣膜置换术是治疗终末期心脏瓣膜病的主要方法，但目前临床应用的人工瓣膜的远期效果尚不令人满意。近年来，随着组织工程学技术的进展，利用培养的自身组织细胞种植于支架材料表面，体外重建理想的心脏瓣膜移植物日益成为研究热点，并取得一定进展。在组织工程研究中，寻找能充分发挥组织再生潜力的仿生型细胞外基质-支架材料是一重要内容和难点之一。支架材料主要承担瓣膜力学构型和细胞粘附载体的作用，它不仅影响细胞的生物学行为和培养效率，而且决定着移植后能否与机体很好的适应、结合、修复和替代的效果，是限制组织工程能否真正应用于临床的一个关键因素。本文综述近年来组织工程心脏瓣膜支架材料研究进展情况，并指出目前研究中存在的问题和下一步研究中需攻克的技术难题。

　　关键词 支架材料,组织工程,心脏瓣膜

　　心脏瓣膜病是一种严重危害人类健康的多发病、常见病，瓣膜置换术是治疗终末期瓣膜病最有效的手段。目前临床上使用的机械瓣、生物瓣及同种瓣均不是理想的心脏瓣膜替代物，仍存在难以解决的问题。机械瓣术后需终生抗凝治疗，抗凝治疗不当导致的出血与栓塞占换瓣术后远期并发症的首位，其他尚有感染性心内膜炎、瓣膜机械故障等;生物瓣术后虽不需终生抗凝，但耐久性差仍是其主要缺陷，大多数患者因生物瓣毁损而面临第二次手术。从而大大增加其危险性和病死率;同种瓣则存在体内排异反应导致瓣膜衰败钙化和取材来源受限等问题。上述这些瓣膜均无生长性，儿童换瓣将面临困难的选择。而始于90年代中期的组织工程心脏瓣膜，利用组织工程学原理和技术，将自体细胞种植在可降解支架材料上培育出的自体心脏瓣膜，具有良好的组织相容性、无免疫原性、耐久性好、不需终生抗凝，而且具有生物活性，能为生长期患儿提供潜在的生长能力，并可修复累加的创伤。所以，这是一种全新而理想的人工心脏瓣膜，在其研究和应用方面将有广阔的前景。

　　1 组织工程心脏瓣膜

　　1.1 组织工程 组织工程(Tissue Engineering，TE)是近年来正在兴起的一门新学科，属于生物高技术范畴。组织工程一词最早是在1987年美国科学基金会在华盛顿举办的生物工程小组会上由美国化学工程师Robert Langer和外科医生Joseph.p.Vacanti [1] 提出，1988年正式定义为:应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理 ˇ 两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。它涉及细胞生物学、分子生物学、化学、生物材料工程、临床等诸多领域，属于系统的多学科性研究范畴。组织工程的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，这与传统的二维结构(如细胞培养)有着本质的区别，其最大优点是可形成具有生命力的活体组织，对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代和完美塑形。

　　1.2 组织工程心脏瓣膜(TEHV) 1995年Shinoˉka [2] 应用组织工程技术，将羊成纤维细胞(fibroblast，FBC)及血管内皮细胞依次种植于可逐步在体内降解的人工合成聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)/聚乳酸(polylactic acid，PLA)支架上制成瓣叶，植入羊肺脉瓣后瓣处8周后取出，发现其外形、基质的胶原纤维、弹力纤维、凝血Ⅷ因子含量均与天然瓣膜相似，荧光染色检查显示种植的内皮细胞及成纤维细胞生长良好。自此，TEHV的研制在国内外掀起热潮，成为心脏瓣膜外科研究领域的重大前沿性课题。各国学者对瓣膜支架材料、种子细胞、搏动性生物反应器、瓣膜的体外构建以及动物体内移植都相继进行了广泛研究。

　　2 支架材料-胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的仿生

　　2.1 支架材料的作用及要求 Terada等 [3] 指出理想的组织工程支架材料通常应具备以下特点:(1)良好的生物相容性:其本身或降解产物对种子细胞和机体无毒性，不致畸，不会引起炎症和免疫排斥反应，还要利于种子细胞粘附、生长和分化;(2)适度的生物降解速率:且该降解速率需和组织再生的速率相匹配，最后可完全吸收或安全地排出体外，降解时间应能根据组织生长特性进行人为调控或自我调整;(3)良好的结构相容性:能保持稳定的三维立体结构，海绵状或纤维网状三维支架应具有互相连通的孔结构与高达90%以上的孔隙率，孔径大小适当，具有较高的面积/体积比，可以为种子细胞的均匀分布和生长提供足够的空间，同时也有利于营养物质和代谢产物的扩散;(4)良好的可塑性和一定的机械强度:基质材料应可预先制作成一定形状，并具有一定的机械强度，为新生组织提供支撑，并保持一定时间直至新生组织具有自身生物力学特性;(5)良好的材料-细胞界面:材料应能提供良好的材料-细胞界面，利于细胞粘附、生长，更重要的是能激活细胞特异基因表达，维持正常细胞表型表达。(6)易于消毒。

　　2.2 支架材料的选择与应用 目前主要采用3类支架材料:(1)去细胞成份的生物瓣(同种或异种)，如猪主动脉瓣或人肺动脉瓣等;(2)天然材料，如明胶、胶原、弹力蛋白、壳聚糖、纤维蛋白凝胶(fibringel)等;(3)可降解型高分子材料:Polyglycoliacid(PGA)，Poly-4-hydroxybutyrate(P4HB)，Polyhydroxyoctanoate(PHO)，Polyhydroxyalkanoate(PHA)等。

　　2.2.1 去细胞瓣膜支架 1999年O’Brien [4] 首先报道应用去细胞猪主动脉瓣移植于4～6个月大的Suffolk羊肺动脉瓣区150d，有成纤维细胞长入瓣叶支架和新的基质形成，经原子吸收光谱测定没有钙化迹象。Steinhoff等 [5] 将经去细胞处理的猪带瓣管道种植细胞后植入羊肺动脉瓣区观察3个月，发现种植细胞和未种植细胞组瓣叶表面均有完整的内皮细胞覆盖。国内刘维永 [6] 等用未经戊二醛处理的去细胞猪主动脉瓣体外种植犬主动脉壁间质细胞和内皮细胞后移植于犬腹主动脉内，10周末瓣叶完全重塑，在新构成的瓣叶中可检测到Ⅰ、Ⅲ型胶原、弹力纤维和粘多糖，间质细胞部分呈α-平滑肌肌动蛋白阳性表达，内皮细胞覆盖于瓣叶表面，Ⅷ因子染色为阳性。认为去细胞猪主动脉瓣构建的组织工程瓣具有活性，其组织相容性优于人工合成材料。最近，P.Simon等[7]在临床给4例儿童用去细胞猪主动脉和肺动脉带瓣管道Synergraft TM(500型和700型)(Cryolife Inc.，USA)行Ross术和右室流出道重建，结果却与前面学者的动物实验截然不同，4例儿童分别在术后2天、7天、6周和1年全部死亡，死亡原因是早期瓣膜穿孔破裂和晚期瓣膜褪变衰败所致的心 性猝死，对这种去细胞而又没有再细胞化的生物移植物做解剖学、组织学和细胞学检查发现:在管道外有纤维素鞘形成并向管内延伸导致吻合口严重狭窄;早期是严重而强烈的非特异性炎症反应，晚期有淋巴细胞反应和钙盐沉积;4例移植物上均没有自体细胞生长。研究者发现Synergraft TM在移植前存在去细胞不完全和钙盐沉积，建议应停用此产品，需要进一步改进。最近德国Wilhelmi MH等 [8] 报道种植了自体细胞和未种植自体细胞的去细胞异种猪带瓣管道植入羊肺动脉瓣区，6个月时二者都显示在瓣叶和管壁有内皮细胞覆盖，但到6、9、12个月时二者带瓣管道都有严重的微血管增生、钙化和细胞渗入，管壁有中等度褪变，研究认为炎症反应在褪变中扮演关键角色，缺血影响不大，炎症趋化因子是这一过程的中心。Leyh RG等 [9]在同种(AVMC)和异种去细胞带瓣管道(XVMC)体内再细胞化的研究中，用去细胞的绵羊和猪带瓣管道(各3只)移植于绵羊肺动脉瓣区，经胸超声检测瓣膜功能和钙化情况，不同时期宰杀后行组织学和生化检查，结果显示，AVMC在12周时有严重钙化和团簇内皮细胞覆盖，但没有瓣膜间质组织重建;作为对照的XVMC显示在24周时有较轻的钙化和连续内皮细胞覆盖，免疫细胞化学检查显示von Willebrand因子、Vimentin/Desmin阳性，证实有内皮细胞和成肌纤维细胞生成。Dohmen PM等将种植了自体血管内皮细胞的去细胞猪主动脉瓣移植于青壮年绵羊的右室流出道，瓣膜功能良好，瓣叶表面有单层内皮细胞覆盖，且有成纤维细胞长入支架，瓣膜含钙量极少。德国柏林Humholdt大学Charit医院Dohmen等 [10] 报告，他们在2000年5月20日为1例因主动脉瓣严重钙化而狭窄的43岁男性病人行Ross手术，用组织工程心脏瓣膜(TEHV)重建右室流出道(RVOT)，术后随访2年，TEHV血液动力学性能良好，未发生钙化，病人生活质量较高，无排异反应。具体操作过程为在瓣膜置换术前4周，研究者从病人左前臂取一段静脉，从静脉收集病人自体活血管内皮细胞(AVEC)，并进行分离、鉴定和扩增。当获得足够数量的AVEC后，将移植用的同种异体带瓣肺动脉的内皮细胞和间质细胞除掉，在其表面覆盖一层基底膜糖蛋白，然后将其接种于生物反应器内，让AVEC附着在其表面。术后进行超声心动图、磁共振和多层面体层摄影检查，评估病人的生活质量、临床和血液动力学状况。结果显示，随访期间未发生TE瓣膜反流。磁共振检查显示，TE瓣瓣叶柔韧，活动平稳。多层面体层摄影检查显示，术后2年，TE瓣膜无钙化。但去细胞成份的生物瓣由于其潜在的免疫原性和体内不完全降解性，实用价值尚需长期观察。

　　2.2.2 天然瓣膜支架 国内赵东锷、汪钢等 [11，12] 分别以去细胞猪主动脉瓣、胶原膜、PHB、PLGA为支架，以犬主动脉壁间质细胞和内皮细胞为种子细胞构建TEHV，对比研究筛选出去细胞猪瓣和胶原膜是较为理想的支架材料，但以胶原膜为支架TEHV的力学特性尚需改进。P.M Taylor等 [13] 用人心脏瓣膜间质细胞(ICs，nterstitial cells)种植在胶原海绵上表达了波形蛋白、成纤维细胞表面抗原和平滑肌肌动蛋白，认为胶原海绵是一种合适的可降解生物支架，它可提高细胞表型的表达和维持ICs活性。Steˉfan Jockenhoevel等 [14] 用纤维蛋白凝胶(加入抑肽酶控制其降解速度)构建出有活性带瓣管道。天然材料具有良好的生物相容性，可以促进细胞的粘附和生长，但不同材料间存在种群差异，且产量增加困难，价格昂贵。

　　2.2.3 人工合成高分子材料 目前国际上用于细胞种植的支架材料多数学者采用聚乳酸/聚乙醇酸和聚羟基酯等聚酯类合成高分子材料，这类材料的优点是有更大的可控性和批与批之间的重复性，可预先塑形，大量制备，孔径和孔隙率较易控制，成本低廉，但也存在一些固有不足，如具有亲油性、生物相容性细胞亲和性及机械强度尚待改进等，而且还有体内降解过程中局部酸性产物蓄积等问题。它自Shinoka始曾一度成为研究的热点，但基于以上缺点，现在已逐渐被天然瓣膜支架和去细胞瓣支架材料所取代。

　　3 TEHV支架材料的发展方向

　　生物体的细胞外基质为复杂的蛋白质和糖胺聚糖形成的物理与化学交联网络，该基质不仅使细胞在空间组构形成特定的组织，而且还由此为其提供和传导环境信号，引起细胞粘连，并形成一组织与另一组织的间隔。为了提高生物材料的生物相容性和细胞亲和性，通过在生物材料表面引入化学信使，使其和细胞表面相应受体组装形成配合物，可以实现分子识别而用于组织工程。如在材料表面固定蛋白质、氨基酸及其衍生物、多肽、生长因子等诱发所期望的细胞响应。另外，可改变材料表面的局部结构特征进一步对生物材料实施表面工程化，如用适宜的自组装单层(SAMs)可调控表面化学结构，用纳米技术使材料表面具有纳米级孔、岭、嵴、沟等结构以增强细胞的粘附力和迁移能力。 4 存在的问题和展望TEHV自1995年以来，在欧美几个心血管医学中心已进行了比较多的研究，早期结果令人鼓舞，从总体上看，仍处于探索阶段，国内更是滞后。要筛选出较理想的支架材料还有不少问题需要解决:(1)目前主要应用的各种瓣膜支架材料生物学性能有待进一步提高。(2)支架材料与移植细胞的基因表达、生物信号建立与调控等均有待进一步研究和揭示。(3)瓣膜三维支架力学构型和细胞亲合技术、支架血流剪切力抵抗、植入动物体内远期疗效评估尚待进一步改进。应用组织工程原理构建出天然的、更符合生理的自体心瓣膜，在不远的将来造福于广大心脏瓣膜病患者还需要我们付出艰辛的努力。

　　参考文献

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