Ⅰ期非小细胞肺癌中侵袭与转移相关蛋白的表达及其预后意义

　　作者：谢泽明,朱志华,张兰军,戎铁华,吴秋良　　作者单位：中山大学肿瘤防治中心： 1胸科，2病理科，广东 广州

　　【摘要】 目的：研究Ⅰ期非小细胞肺癌(NSCLC)中侵袭与转移相关蛋白Cd44v6,癌胚抗原 (CEA), 钙粘连蛋白(Ecadherin),基质金属蛋白酶2 (MMP2),MMP9,β连环素(βCatenin)的表达及其与预后的关系. 方法： 用组织芯片结合免疫组织化学法检测80例Ⅰ期非小细胞肺癌患者石蜡标本中Cd44v6，CEA，Ecadherin，MMP2，MMP9，βCatenin的表达，对表达强度进行6级评分，结合临床病理数据分析各标志物的表达与预后的关系. 结果： 本组80例Ⅰ期NSCLC的5 a生存率为68%. 单因素分析中，仅MMP2有预后意义(Logrank test,P=0.046). 在包括Cd44v6，CEA，Ecadherin，MMP2，MMP9，βCatenin，年龄，性别，病理类型的多因素分析中，也仅有MMP2是影响预后的独立因子，MMP2高表达者预后较差(P=0.003). 结论： 在6种侵袭与转移相关蛋白中，只有MMP2可作为Ⅰ期NSCLC的预后因子，MMP2高表达者预后较差.

　　【关键词】 癌,非小细胞肺,预后,组织芯片,生物学标记

　　【Abstract】 AIM: To investigate the expressions of Cd44v6, carcinoembryonic antigen (CEA), Ecadherin, matrix metalloproteinase2(MMP2), MMP9, βCatenin in stage Ⅰ nonsmallcell lung cancer (NSCLC) and their prognostic values. METHODS: The expressions of the six proteins were evaluated by immunohistochemistry with tissue chip in paraffinembedded specimens from 80 consecutive NSCLC patients. Clinicopathological data were employed to investigate the expression rules and their prognostic values. RESULTS: The 5year survival rate of these 80 stage Ⅰ NSCLC patients was 68%. Among the 6 proteins, only MMP2 was of prognostic value in Logrank test(P=0.046). In Cox multivariate analysis which employed the six biomarkers, including Cd44v6, CEA, Ecadherin, MMP2, MMP9, βCatenin, age, sex, and pathological subtype, MMP2 remained the only independent prognostic factor(P=0.003). CONCLUSION: Among the six proteins related to cancer invasion and metastasis, MMP2 is the only biomarker which has prognostic value in stage Ⅰ NSCLC.

　　【Keywords】 carcinoma, nonsmallcell lung; prognosis; tissue chip, biological markers

　　0 引言

　　对于Ⅰ期或者Ⅱ期的早期非小细胞肺癌(nonsmallcell lung cancer, NSCLC)患者，目前的主要治疗手段是外科手术，但即使是IA期的患者术后仍有约30%遭遇复发或转移. 近几年来NSCLC辅助化疗(包括新辅助化疗和术后辅助化疗)和靶向治疗发展迅猛，但对于如何确定同一肿瘤淋巴结转移(tumor node metastasis，TNM)分期中的患者，特别是I期的NSCLC患者是否需要辅助治疗的问题仍然悬而未决，也就是说还存在“过度治疗”或“治疗不足”的问题. 肿瘤细胞对细胞间连接复合体的破坏以及对细胞外基质的降解是肿瘤转移发生过程中的重要步骤. 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)，基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)，MMP9，钙粘连蛋白(Ecadherin)，β连环素(βCatenin)等是参与这一过程的重要成员. 本研究利用组织芯片技术，通过免疫组化方法，检测了Ⅰ期NSCLC组织中与恶性肿瘤侵袭和转移相关的蛋白MMP2等蛋白的表达情况，探讨它们对Ⅰ期NSCLC预后的影响，以期发现有助于界定高危患者的分子生物学指标.

　　1 对象和方法

　　1.1 对象198912/200012中山大学肿瘤防治中心收治Ⅰ期NSCLC患者80(男60，女20)例 ，年龄16～72(中位55)岁. TNM分期： ⅠA期(T1N0M0)10例，ⅠB期(T2N0M0)70例. 病理类型： 鳞癌28例，腺癌52例. 所有患者当时未进行术后辅助化疗.

　　1.2 方法

　　1.2.1 组织芯片的制备和免疫组化检测 利用存档的石蜡标本，参考Kononen等[1]的方法在陕西超英生物科技有限公司实验室制作完成组织芯片. 免疫组化染色步骤按试剂盒说明进行. 阳性对照采用已知阳性标本，PBS代替一抗作阴性对照.

　　1.2.2 结果判断 根据阳性细胞占全部细胞的比例，将无阳性细胞者记录为“0”;阳性细胞数<10%记录为“Ⅰ”;阳性细胞数10%～25%记录为“Ⅱ”;阳性细胞数26%～50%记录为“Ⅲ”;阳性细胞数50%～75%记录为“Ⅳ”;阳性细胞数>75%记录为“Ⅴ”. 两位病理学专家独立阅片，确定免疫组化结果，不一致处协商后取得共识.

　　1.2.3 随访 患者资料随访收集方式包括： 定期门诊复查、信访登记、电话随访等. 生存时间按天计算，对死亡患者，生存时间为手术日期至患者死亡日期的天数;对生存患者，生存时间为手术日期至最后一次随访日期的天数.

　　统计学处理： 采用SPSS11.0统计软件进行数据处理. 单因素生存分析用KaplanMeier法;用Cox比例风险模型进行多因素分析，P ≤0. 05为有统计学差异.

　　2 结果

　　80例患者随访至20060431(53/80)，随访率100%. 随访时间为150～ 5392(中位2539) d. 随访期间53例生存，死亡27例，其中死于肿瘤者26例，死于脑溢血1例,5 a生存率为68%. Cd44v6和βCatenin的阳性表达位于细胞浆和细胞膜，CEA，MMP2，MMP9，ECadherin的阳性表达位于细胞质. 经单因素分析，各生物学标志物中，仅MMP2的表达水平与预后相关(P=0.046,表1). MMP9，CEA和cd44v6的表达水平与Ⅰ期NSCLC的预后无显著关系(表1). 另外ECadherin和βCatenin亦与Ⅰ期NSCLC的预后无关(P值分别为0.942和0.888). 将Cd44v6，CEA，Ecadherin，MMP2，MMP9，βCatenin，性别，年龄，肿瘤病理类型等因素综合进行多因素分析，也仅有MMP2是影响预后的独立因子，MMP2高表达者预后较差(P=0.003，表2).

　　表1 各生物学标志物表达水平与预后的关系(单因素分析)(略)

　　*n<10时为比值.

　　表2 COX比例风险模型多因素分析(略)

　　RR=risk ratio; 95%(CI): 95%置信区间.

　　3 讨论

　　细胞外基质的降解主要依靠丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶等4类蛋白水解酶，其中基质金属蛋白酶是最为重要的一类，几乎能降解细胞外基质的所有成分. 对基质金属蛋白酶的免疫组化研究主要集中在其中的MMP2和MMP9(又称明胶酶2和9). 大多数研究表明MMP2和MMP9的高表达是非小细胞肺癌的负面预后因子，特别是MMP2[2-5]. 癌胚抗原( CEA),钙粘连蛋白,基质金属蛋白酶2(MMP2),MMP9,β连环素(βCatenin).

　　Ecadherin和Catenin是重要的细胞间联结蛋白成分，对于维持上皮细胞的细胞间联结起重要作用,因此Ecadherin和Catenin的表达减少可能影响肿瘤的分化、转移和预后. 在关于Catenin与非小细胞肺癌的预后研究中[6-12]，约有30%的非小细胞肺癌存在βCatenin表达减少，部分研究报道β连环素表达减少与预后较差相关[8-11]. 有关非小细胞肺癌的ECadherin免疫组化研究中，有部分报导结果表明，正常表达ECadherin者预后较好，也有部分研究认为其与预后无关[6,8-10,12-14].

　　CD44是分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，在淋巴细胞，成纤维细胞表面均能检测到它的表达. CD44蛋白属于未分类的粘附分子，其正常功能是作为受体识别透明质酸(HA)和胶原蛋白Ⅰ，Ⅳ等，主要参与细胞细胞，细胞基质之间的特异性粘连过程. CD44V6高表达的癌细胞可能获得淋巴细胞“伪装”，逃避人体免疫系统的识别和杀伤，更易进入淋巴结，形成转移. Toshiki等[15]的研究表明，Ⅰ期非小细胞肺癌中，CD44V6阳性者五年生存率明显低于阴性者. Nguyen等[16]的研究也得出类似的结论，即CD44V6而非CD44s有预后意义，CD44V6阳性者预后较差.

　　CEA被认为是有别于黏附分子cadherin的一种细胞间黏附分子. 此外，CEA也可能是抑制细胞接触的一种蛋白质信号，可促进细胞迁移形成转移灶，并可抑制免疫系统的细胞毒效应细胞与表达CEA的细胞之间的接触，使肿瘤细胞逃避免疫攻击. 相对于血液中的CEA检测，用免疫组化检测原发肿瘤中的CEA表达阳性率更高，因为血清中的CEA水平不仅决定于原发肿瘤的CEA分泌，还与肿瘤负荷有关[17]，Nakamura等[18]报导非小细胞肺癌血清中CEA的阳性率为20%，原发肿瘤免疫组化阳性率为60%，RTPCR阳性率为80%，具体的预后价值还有待大样本临床研究来确定.

　　我们运用高通量组织芯片技术，同时检测同一分期的非小细胞肺癌中与侵袭和转移相关的多种蛋白的表达，并对表达强度进行细分，结合随访数据等进行分析，结果表明这一类蛋白中，仅MMP2是影响I期非小细胞肺癌预后的独立因子. 至于在其他分期的非小细胞肺癌中,哪些侵袭和转移相关蛋白起关键作用并对预后有影响还有待进一步研究.

　　【参考文献】

　　[1] Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, et al. Tissue microarrays for highthroughput molecular profiling of tumor specimens[J]. Nat Med,1998，4(7):844-847.

　　[2] Kim SJ, Rabbani Z, Dewhirst MW, et al. Expression of HIF1a, CAIX, VEGF, and MMP9 in surgically resected nonsmall cell lung cancer[J]. Lung Cancer, 2005，49:325-335.

　　[3] Passlick B, Sienel W, SeenHibler R, et al. Overexpression of matrix metalloproteinase 2 predicts unfavorable outcome in earlystage nonsmall cell lung cancer[J]. Clin Cancer Res, 2000，6:3944-3948.

　　[4] Ishikawa S, Takenaka K, Yanagihara K, et al. Matrix metalloproteinase2 status in stromal fibroblasts, not in tumor cells, is a significant prognostic factor in nonsmallcell lung cancer[J]. Clin Cancer Res, 2004，10:6579-6585.

　　[5] Sienel W, Hellers J, MorresiHauf A, et al. Prognostic impact of matrix metalloproteinase9 in operable nonsmall cell lung cancer[J]. Int J Cancer, 2003，103:647-651.

　　[6] Ramasami S, Kerr KM, Chapman AD, et al. Expression of CD44v6 but not Ecadherin or bcatenin influences prognosis in primary pulmonary adenocarcinoma[J]. J Pathol, 2000，192:427-432.

　　[7] Pirinen RT, Hirvikoski P, Johansson RT, et al. Reduced expression of acatenin, bcatenin, and ccatenin is associated with high cell proliferative activity and poor differentiation in nonsmall cell lung cancer[J]. J Clin Pathol, 2001，54:391-395.

　　[8] Kase S, Sugio K, Yamazaki K, et al. Expression of Ecadherin and betacatenin in human nonsmall cell lung cancer and the clinical significance[J]. Clin Cancer Res, 2000，6:4789-4796.

　　[9] Lee YC, Wu CT, Chen CS, et al. The significance of Ecadherin and a,b,and ccatenin expression in surgically treated nonsmall cell lung cancers of 3 cm or less in size[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2002，123:502-507.

　　[10] Bremnes RM, Veve R, Gabrielson E, et al. Highthroughput tissue microarray analysis used to evaluate biology and prognostic significance of the Ecadherin pathway in nonsmallcell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2002，20:2417-2428.

　　[11] Hommura F, Furuuchi K, Yamazaki K, et al. Increased expression of bcatenin predicts better prognosis in nonsmall cell lung carcinomas[J]. Cancer,2002，94:752-758.

　　[12] Choi YS, Shim YM, Kim SH, et al. Prognostic significance of Ecadherin and bcatenin in resected stage Ⅰ nonsmall cell lung cancer[J]. Eur J Cardiothorac Surg, 2003，24:441-449.

　　[13] Liu D, Huang CL, Kameyama K, et al. Ecadherin expression associated with differentiation and prognosis in patients with nonsmall cell lung cancer[J]. Ann Thorac Surg, 2001;71:949-955.

　　[14] Salzer MA, Leers MPG, van Noord JA, et al. Reduced Ecadherin expression is associated with increased lymph node metastasis and unfavorable prognosis in nonsmall cell lung cancer[J]. Am J Respir Crit Care Med,1998，157:1319-1323.

　　[15] Toshiki H， Tatsuo F， Hironobu N， et al. Expression of CD44 Variant Exon 6 in Stage Ⅰ NonSmall Cell Lung Carcinoma as a Prognostic Factor[J]. Cancer Res, 1998，58:1108-1110.

　　[16] Nguyen VN，Mirejovsky T， Melinova L， et al. CD44 and its v6 spliced variant in lung carcinomas: relation to NCAM, CEA, EMA and UP1 and prognostic significance[J]. Neoplasma, 2000，47(6):400-408.

　　[17] Ford C, Stokes H, Newman C, et al. Carcinoembryonic antigen and prognosis after radical surgery for lung cancer: Immunocytochemical localization and serum levels[J]. Br J Cancer, 1981，44:145-153.

　　[18] Nakamura H, Saji H, Idiris A, et al. Comparison of immunohistochemistry and realtime reverse transcriptionpolymerase chain reaction to detect expression of carcinoembryonic antigen in lung cancer[J]. Oncol Rep, 2003，10:1231-1235.