良恶性胸腔积液中二氢二醇脱氢酶2表达水平及意义

　　作者：胡韦华1,2,姜藻3　　作者单位：1. 东南大学临床医学院,江苏南京 210009; 2. 南京胸科医院呼吸一科,江苏南京 210029;3. 东南大学附属中大医院肿瘤中心,江苏南京 210009

　　【摘要】目的： 研究良恶性胸腔积液中二氢二醇脱氢酶(dihydrodiol dehydrogenas，DDH)2的表达水平,探讨其对良恶性胸水鉴别诊断价值。方法： 分别采用竞争性ELISA法、微粒子酶免疫实验、固相夹心法酶联免疫吸附试验检测66例胸腔积液患者胸水中DDH2、癌胚抗原(CEA)及γ干扰素水平。结果： 恶性胸腔积液中DDH2、CEA表达水平显著高于良性组(P<0.05)，γ干扰素表达水平良性组显著高于恶性组(P<0.05)。结论： 胸腔积液中DDH2的检测对良、恶性胸腔积液有一定的鉴别诊断价值,DDH2、CEA、γ干扰素联合检测有助于恶性胸腔积液的临床诊断。

　　【关键词】 胸腔积液,二氢二醇脱氢酶, 肺癌

　　良恶性胸腔积液的鉴别诊断一直是临床工作者和实验室研究人员面临的难题。结核和肿瘤为渗出性胸液的两大最常见原因,由于胸水中的结核杆菌和癌细胞的检出率低,导致良恶性胸腔积液鉴别困难。随着肿瘤分子生物学的发展,寻找新的可用于良恶性胸水鉴别诊断的标志物成为可能。国内外大量文献表明二氢二醇脱氢酶(dihydrodiol dehydrogenas，DDH )在包括肺癌在内的多种肿瘤中过度表达,国内亦有其关于肺癌及良性疾患的血清学研究,胸腔积液中DDH的表达水平的研究尚未见报道,为此,我们通过检测DDH亚型之一DDH2在胸腔积液中的表达水平,并同步检测公认的良、恶性胸腔积液标志物癌胚抗原(CEA)、γ干扰素等,以进一步探讨其临床意义。

　　1 资料和方法

　　1.1 研究对象

　　选择本院2007年10月至2008年12月收治的胸水患者66例,其中癌性胸水36例，非癌性胸水患者30例。癌性胸水患者中男19 例,女17 例;年龄44.0～83.0(66.11±11.37)岁。肺癌致胸水31例,包含腺癌26例、鳞癌3例、小细胞肺癌2 例,其他肿瘤(食管癌、直肠癌各1例,肝癌转移2例,前纵隔恶性肿瘤1例)致胸水5例,所有病例均经各种检查获得病理学诊断。 30例非癌性胸水患者中男20 例,女10 例;年龄16.0～83.0(48.57±28.00)岁。其中漏出液2例,渗出液28例,包括结核性胸膜炎23例,经临床确诊且经抗结核治疗后胸水吸收;肺炎旁积液2例,脓胸2 例,胸水检查符合炎症诊断,经抗感染治疗后胸水吸收。自身免疫性疾患致胸水1 例。癌性胸水患者的年龄大于非癌性胸水患者(P<0.01)。

　　1.2 主要试剂

　　AKR1C2单克隆抗体(H00001646M03, Abnova公司)、AKR1C2重组蛋白(H00001646Q01,Abnova公司)、HRP结合的兔抗GST抗体(GenScript)、牛血清白蛋白(Sigma公司)、微粒子酶免疫实验(EIA) CEA试剂盒(美国Abbott公司)、γ干扰素 ELISA试剂盒(法国 Diaclone公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 收集标本 每一病例均于入院后行胸腔穿刺,无菌条件下采集胸水标本10ml,均以3600r•min-1离心10min,将胸水上清液放入冻存管中,-80℃低温冷冻备用。

　　1.3.2 用竞争性ELISA法测定胸腔积液DDH2水平 96孔酶标板用洗涤缓冲液洗涤后,各加100μl(10μg•ml-1) AKR1C2单克隆抗体(Abnova公司)4℃包被过夜,洗涤后加入250μl小牛血清室温封闭1h,洗涤,每孔加入100μl待测样品(胸水),室温孵育2h,清空并予PBST缓冲液洗板3次,每孔加入100μl AKR1C2重组蛋白(Abnova公司)稀释液(饱和量),室温孵育2h,清空并予PBST缓冲液洗板3次,每孔加入HRP结合的兔抗GST多克隆抗体(GenScript 0.1μg•ml-1)100μl孵育2h, 加底物TMB液显色;终止反应后,用全自动酶标仪在波长450 nm处以空白对照孔调零后测OD值。试验同时用AKR1C2单克隆抗体及AKR1C2重组蛋白同步反应绘制标准曲线。根据标准曲线、OD值、饱和浓度推算每孔所含DDH值。

　　1.3.3 采用微粒子酶免疫实验法测定胸腔积液中CEA水平 试剂盒购自美国雅培公司,按说明书要求操作,用全自动免疫分析仪自动显示样本CEA浓度(ng•ml-1)。

　　1.3.4 采用固相夹心法ELISA测定胸腔积液中γ干扰素水平 试剂盒为深圳市炬英生物科技有限公司代理，操作按试剂盒说明进行。

　　1.4 统计学处理

　　实验数据用x±s表示,应用SPSS 13.0统计软件包作统计学处理。计量资料用t检验,计数资料采用χ2检验,相关分析用直线相关及逐步回归分析。计算灵敏度、特异度、准确度、YOUDEN指数(M)等诊断评价指标。

　　2 结 果

　　2.1 良恶性胸腔积液中DDH2、CEA、γ干扰素的表达水平 见表1。所有患者胸腔积液中均可检测到DDH2,但水平不同,其浓度在恶性胸腔积液中为78～295μg•dl-1,在良性胸腔积液中为77～306μg•dl1 (2例患者DDH2>300μg•dl-1者均为脓胸)。从表1可知DDH2良恶性胸腔积液表达水平有显著差异,P=0.0152,恶性胸水中DDH2含量高于良性组。恶性胸腔积液中CEA表达显著高于良性疾患致胸水,P<0.001。恶性胸腔积液中γ干扰素表达水平显著低于良性疾患致胸水,P<0.001。表1 良恶性胸腔积液中DDH2、CEA、γ干扰素表达水平

　　同恶性组比较，1) P=0.0152，2) P<0.0012.2 DDH2、CEA、γ干扰素对64例渗出性胸腔积液的良恶性检测界值及检测结果 根据受试者工作特性曲线,选取具有最佳灵敏度和特异度的点作为鉴别诊断的阳性界值。以 CEA>8ng•ml-1为恶性疾患阳性检出标准,恶性组28 例阳性,阳性率为77.78%(28/36),良性组2例阳性, 阳性检出率为7.14%(2/28)，恶性组阳性检出率显著高于良性组(χ2=31.5558，P<0.05)。以γ干扰素>49ng•L-1为良性疾患阳性检出标准,恶性组1例阳性,阳性率为2.78%(1/36),良性组23例阳性,阳性检出率为82.14%(23/28),良性组阳性检出率显著高于恶性组(χ2=42.3280，P<0.05)。以DDH2>179.50μg•dl-1为恶性疾患阳性检出标准,恶性组29例阳性,阳性率为 80.56%(29/36),良性组10例阳性,阳性率为35.71%(10/28),恶性组阳性检出率显著高于良性组(χ2=13.3043，P<0.05)。

　　2.3 DDH2、CEA、γ干扰素对64例渗出性胸腔积液的良恶性鉴别诊断效能 分别以DDH2179.50μg•dl-1、γ干扰素49ng•L-1、CEA8ng•ml-1为诊断界值，评价三者对良恶性胸腔积液的鉴别诊断效能。DDH2、CEA、γ干扰素单独用于胸腔积液良恶性鉴别诊断的ROC曲线下面积分别为0.720、0.933、0.877,YODEN指数分别为0.446、0.708、0.894。DDH2+CEA、DDH2+CEA+γ干扰素对恶性胸腔积液的检测YODEN指数分别为0.766、0.893。DDH+γ干扰素、DDH2+CEA+γ干扰素对良性胸腔积液的检测YODEN指数分别为0.607、0.547。见表2。

　　2.4 DDH2与其他指标的多元分析

　　胸腔积液中DDH2 表达水平与CEA表达水平行相关性分析，结果不具有统计学意义(Pearson相关系数r=0.116，P=0.353)。 胸腔积液中DDH2表达水平与γ干扰素表达呈显著负相关(Pearson相关系数 r=-0.387，P=0.001)。将DDH2与性别、年龄进行多元相关分析,结果显示DDH2与这些指标无相关性。

　　3 讨 论

　　DDH为醛酮还原酶超家族成员(aldokedo reductase表2 DDH2、CEA、γ干扰素单独及联合检测对64例渗出性胸水良恶性鉴别诊断效能分析(鉴别良性)50.0100.0∞0.45270.547 注：DDH2+CEA联合检测采用并联法,即DDH2>179.50μg•dl-1、CEA>8ng•ml-1有1项符合即视为阳性,DDH2+γ干扰素联合用于良性检测采用串联法,即DDH2<179.50μg•dl-1、γ干扰素>49ng•L-1两项均符合即视为阳性。3项指标联合检测对良性检测采用串联法,即 DDH2<179.50μg•dl-1,CEA<8ng•ml-1 、γ干扰素>49ng•L-1均符合视为阳性,3项指标联合检测对恶性检测采用并联加串联法,即DDH2>179.50μg•dl-1、CEA>8ng•ml-1有1项符合同时具备γ干扰素<49ng•L-1视为阳性superfamily， AKR1)之一,相对分子质量为34000～36000,主要分布在人和动物(鼠、猪等)的肝脏和肾脏中[1]，生理情况下主要参与体内多环芳烃的生物转化和激素的代谢。Penning等[2]研究表明，DDH可能在某些细胞器(如线粒体、高尔基体等)中经生物合成后再分泌到细胞浆内,通过旁分泌或者自分泌的方式作用于靶组织。经质谱仪蛋白质组学研究证实其为一种分泌型胞浆蛋白[3],研究结果表明人体的各种组织均有DDH蛋白,但在不同的器官组织内含量相差较大,正常情况下主要位于人类的肝脏和肾脏。DDH在体内主要有4种异构体(亚型),即DDH1～4,不同器官组织亚型相差亦较大,人类肺组织可检出DDH2[4](AKR1C2)。通过免疫组化或原位杂交证实DDH蛋白在多种肿瘤组织中过度表达,几乎见于所有人类常见肿瘤(如胃癌[5]、直肠癌[6] 、肝癌[7]、前列腺癌[8]、肺癌[4]、乳腺癌[9]、皮肤癌[10]、卵巢癌[11]等),其表达与肿瘤的分期、预后、复发率呈正相关,与肿瘤的分化程度无明显相关。DDH在肿瘤发生、发展中的作用尚不明了,研究表明可能与其在体内失衡时,其在外源性致癌物PAH体内代谢过程中产生大量毒性中间产物,如PAH02醌及大量活性氧成分有关[12]。关于DDH与肿瘤血清学研究仅限于DDH2与非小细胞肺癌,提示其可能为非小细胞肺癌的血清肿瘤标志物[3]。关于DDH在胸腔积液中表达情况尚不知,为此我们展开此项研究,通过对66例因不同原因所致胸腔积液于我院住院患者的胸水标本检测,初步探讨其分布特点。

　　本研究中发现所有患者胸腔积液中均可检测到DDH2,但恶性胸腔积液中DDH2含量明显高于良性组(P=0.0152), 结合文献分析胸腔积液中肿瘤细胞高表达DDH2,虽然在良性胸腔积液中其他细胞也可表达,但浓度低于肿瘤细胞分泌量。研究样本中尚包括2例漏出液,分别由肝硬化低蛋白血症和心功能不全引起,从数值上看与良性渗出性胸液亦无明显差别,但因样本量少是否具有统计学意义尚不可知,恶性胸水组中,包括肺癌31例(腺癌26例、鳞癌3例、小细胞肺癌2例),其他肿瘤(食管癌、直肠癌各1例,肝癌转移2例,前纵隔恶性肿瘤1例)致胸水5例,肺癌组与其它转移性肿瘤组DDH2表达分别为(211.45±45.628)、(204.40±23.681)μg•dl-1,肺癌不同病理类型之间数值差异不明显。因转移性肿瘤及非腺性肺癌样本量较少,未作进一步统计学分析。试验检测结果与文献肿瘤组织DDH2表达情况相一致[3,5，89],提示DDH可能为一种非特异性的肿瘤标志物。其在肺癌引起胸腔积液中表达水平明显高于良性疾患引起胸腔积液,这与DDH2肺癌血清学研究较一致[3]。在良性胸水组我们比较了其在结核和非结核原因引起的胸水中的表达水平,二者有较大重叠,因非结核性胸水样本量较小(6例),且包括2例脓胸、2例漏出液,故尚需进一步研究。因DDH2在良恶性胸水中表达水平有明显差异,假设其作为一种良恶性胸水的鉴别诊断指标,我们对其诊断效能进行了进一步分析。根据受试者工作特性曲线,选取具有最佳灵敏度和特异度的点作为鉴别诊断的阳性界值, DDH2>179.50μg•dl-1为阳性时,其对恶性胸水诊断的灵敏度为80.6%、特异度为64.0%,YODEN指数为0.446,ROC曲线下面积为0.720,诊断效能低于CEA,当DDH2与CEA联合检测用于诊断恶性胸水时,灵敏度可达100%,特异度可达75.0%,YODEN指数为0.766,诊断效能高于CEA单独检测时效能。分析CEA作为一种公认的胸水肿瘤标志,虽特异度高(93.0%),但因受限于组织类型(腺癌来源)及胸水形成时间等其他因素,故而敏感性较低。作为一种非特异性的肿瘤标志,对恶性胸水的检测DDH2对CEA起到了互补作用。

　　渗出性胸腔积液主要由结核性胸膜炎和恶性肿瘤性胸膜疾病所致[13],故而作为一种结核性胸膜炎的标志物,γ干扰素在临床上亦被广泛应用于良恶性胸水的鉴别。在抗结核免疫中,TH1免疫应答占优势,TH1细胞分泌大量 γ干扰素[14],而恶性肿瘤性胸腔积液患者细胞免疫功能失去平衡,表现为TH1免疫应答降低[15],故而γ干扰素表达水平在结核和恶性肿瘤胸水中有显著差异。在本研究64例渗出液患者中,γ干扰素检出良性胸水的灵敏度为82.1%,检测特异度为97.2%,ROC曲线下面积为0.897,YODEN指数为0.894,与文献报道相近。我们试以DDH2<179.5μg•dl-1并且γ干扰素>49ng•L-1或DDH2<179.5μg•dl-1、CEA<8ng•ml-1、 γ干扰素>49ng•L-1为阳性界值进行两联及三联检测,对良性胸液的检出效能均较γ干扰素单独检测明显下降,YODEN指数分别为0.607、0.547。故而不建议将DDH2应用于良性胸水的诊断。本次研究尚提示若以DDH2 >179.50μg•dl-1、CEA>8ng•ml-1有1项符合同时具备γ干扰素<49ng•L-1视为阳性标准。此三联检测对恶性胸水的检出效能较DDH2、CEA联合检测可有进一步的提高,YODEN指数为0.893。

　　本研究表明恶性胸腔积液中DDH2表达水平明显高于良性胸腔积液,DDH2对于恶性胸腔积液有一定的诊断价值，但因良恶性组间存在一定重叠不宜单独应用于良恶性胸水的鉴别诊断，其与CEA联合检测有一定的互补性,对于恶性胸水的检测灵敏度明显提高，若与γ干扰素联合可进一步提高对恶性疾患的诊断效能，临床上可根据具体需要灵活选择。

　　【参考文献】

　　[1]SHIRAISHI H,ISHIKURA S,MATSUURA K,et al.Sequence of the cDNA of a human dihydrodiol dehydrogenase isoform (AKRIC2) and tissue distributidistribution of its mRNA[J].Biochem,1998,334：399405.

　　[2]PENNING　T M,BURCZYNSKI M E,HUNG C F，et al.Human 3alphahydroxysteroid dihydrodiol dehydrogenase isoforms (AKR1C14)of the aldoketo reductase superfamily：functional plasticity and tisse distribution reveals roles in the inactivation and formation of male female hormones[J].Biochem J,2000，351(pt1):6777.

　　[3]HUANG L J,CHEN S X,HUANG Y,et al.Proteomicsbased identification of secreted protein dihydrodiol dehydrogenase as a novel serum markers of nonsmall cell lung cancer[J].Lung Cancer，2006，54(1):8794.

　　[4]TIMOTHEADOU E,SKARLOS D V,SAMANTAS E,et al.Evaluation of the prognostic role of a panel of biomarkers in stage IBⅢ A nonsmall cell lung cancer patients[J].Anticancer Res，2007，27(6C):44814489.

　　[5]CHANG H C,CHEN Y L,CHAN C P,et al.Overexpression of dihydrodiol dehydrogenase as a prognostic marker in resected gastric cancer patients[J].Dig Dis Sci，2009，54(2):342347.

　　[6]HARA A,SHIRAISHI H,MATSUURA K,et al.Expression of mRNAs and dihydrodiol dehydrogenase isoforms in human rectum tissues[J].Adv Exp Med Biol，1999，463：539544.

　　[7]YANG M D,WU C C,CHIOU S H,et al.Reduction of dihydrodiol dehy2 drogenase expression in resected hepatocellular carcinoma[J].Oncol Rep,2003,10:271276.

　　[8]宋卫东,周利群,梁莉莉,等.二氢二醇脱氢酶2在前列腺癌中的表达及意义[J].中华泌尿外科杂志,2003,24(9):625627.

　　[9]HENDERSON B E，FEIGELSON H S.Hormonal carcinogenesis[J].Carcinogenesis,2000,21：427433.

　　[10]CHOW K　C,LU M　P,WU M T,et al.Expression of dihydrodiol dehydrogenase plays important roles in apoptosisand drugresistance of A431 squamous cell carcinoma[J].J Dermatol Sci，2005，12(14):315320.

　　[11]CHEN J,ADIKARI M,PALLAI R,et al.Dihydrodiol dehydrogenases regulate the generation of reactive oxygen species and the development of cisplatin resistance in human ovarian carcinoma cells[J].Cancer Chemother Pharmacol，2008，61(6):979987.

　　[12]XUE W,WARSHAWSKY D.Metabolic activation of polycyclic and heterocyclic aromatic hydrocarbons and DNA damage[J].Toxicol Appl Pharmacol，2005，206(1):7393.

　　[13]钟康,蔡后荣.胸腔积液328例临床分析[J].南京铁道医学院学报,1998,17(4): 282283.

　　[14]LI L,LI C Y,NI C.Polymer crystallizationdriven,periodic patteming on carbon nanotubes[J].Journal of the American Chemical Society,2006,128(5)：16921699.

　　[15]ATANACKOVIC D,BLOCK A,de WEERTH A,et al.Characterization of effusion.infiltrating T cells： benign versus malignant effusions[J].Clin Cancer Res,2004,10(8)：26002608.