结扎胸导管对食管癌术后肠道细菌内毒素移位的研究

　　作者：武铁军,陈新,何明,杨利伟,白世祥　　作者单位：河北省邢台市第三医院胸外科(武铁军);河北医科大学第四医院胸二科(陈新、何明、杨利伟、白世祥)

　　【摘要】目的探讨胸导管是否是术后禁食状态下肠道内毒素移位的主要途径。方法血样标本离心后取上清(血浆)，双抗夹心酶联免疫法(双抗夹心ELISA法)测定内毒素含量，所得检测数据相应进行相关检验，分析结扎胸导管对血浆内毒素水平的影响，探讨胸导管是否为内毒素移位的主要途径。结果 年龄和性别对血浆内毒素水平影响差异无统计学意义(P>0.05)。手术后第1～5天内，血浆内毒素水平有很大程度的升高(P<0.01)。食管癌患者术中结扎胸导管组术后血浆内毒素水平和未扎组比较结扎组明显低于未扎组(P<0.01)。结扎胸导管降低了术后血浆内毒素水平。结论 预防结扎胸导管不仅可以预防术后乳糜胸的发生，而且对于阻断内毒素的移位有重要意义，胸导管可能是内毒素移位的主要途径。

　　【关键词】 食管肿瘤;内毒素类;双抗夹心ELISA;胸导管;结扎术

　　目前临床上手术治疗食管癌所必须要面临的一个问题是：如何降低术后患者发生全身炎性反应综合征(SIRS)的概率，SIRS的发生，主要是由于致病因素作用于机体引起全身炎性反应，内毒素(endotoxin)可刺激机体产生多种炎性因子，导致瀑布样级联反应，引起全身炎性反应。肠道细菌(内毒素)移位(bacterial translocation，BT)的概念，指原正常存在于肠道中的活菌从胃肠道腔内转移到胃肠道外组织的现象。内毒素只有通过移位到血浆中，才能产生以上的作用。公认的细菌内毒素移位的主要原因还是肠道黏膜屏障功能的损伤引起的，这种损伤在患者遭受手术创伤而且在禁食状态下更容易发生。但是，关于内毒素进入血液循环的主要途径，是以进入肠系膜淋巴结继而进入胸导管为主，还是以进入门静脉再入血为主，却没有一个比较统一的结论。本研究旨在探讨结扎胸导管与否对血浆内毒素水平的影响，探讨内毒素在机体内移位的主要途径。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 血样标本取自河北医科大学第四医院胸外科2006年11月至2007年2月行食管中段鳞状细胞癌手术的住院患者72例，根据手术结果，并单纯探查手术和姑息手术及术后出现并发症者剔除，剩余病例63例，男36例，女27例;年龄50～65岁，平均年龄58.2岁;随机分为结扎组(n=33)和未扎组(n=30)，均在严格消毒的情况下，于下午14∶00，取患者肘静脉血。

　　1.2 主要试剂及仪器 内毒素定量检测试剂盒(美国RB公司)，肿瘤坏死因子α(TNFα)定量检测试剂盒(美国RB公司)，Rapidbio Lab(美国IPI Inc公司)，HT2型酶标仪(奥地利Anthos公司)，Anke TDL40B型离心机(中国飞鸽公司)。

　　1.3 检测方法 应用双抗夹心ELISA法检测患者血浆标本中内毒素的检测应用双抗夹心ELISA法检测，严格按照说明书指示操作。具体操作步骤如下：阴性对照用无热源0.9%氯化钠溶液，阳性对照用0.5 EU/ml内毒素。(1)准备工作：包括：①器材去热源。②肝素去热源。③标本血浆的制备及准备：血浆标本中含有抑制鲎试验因子，应作预处理：取1 ml静脉血于无热源肝素中，500 r/min，5 min，取血浆0.1 ml，加入无热源0.9%氯化钠溶液0.2 ml，TrisHCl缓冲液0.2 ml，混匀。100℃水浴10 min，3 000 r/min，10 min，取上清液检测。④试剂配置：鲎试剂按标准量加入0.4 mol/L TrisHCL。Mg2+缓冲液，轻轻混匀。亚硝酸钠加入0.4 mol/L盐酸6.2 ml，混匀。氨基磺酸加入蒸馏水6.2 ml，混匀。萘乙二胺加入蒸馏水6.2 ml，混匀。(2)分为测试管(S)、对照管(B)、空白管(阴性对照管，BB)、阳性对照管4组。(3)于S管中加入0.1 ml标本血清和0.05 ml鲎试剂;于B管中加入0.05 ml鲎试剂和0.1 ml无热源0.9%氯化钠溶液;于BB管中加入0.05 ml鲎试剂和0.1 ml无热源0.9%氯化钠溶液;于阳性对照管中加入0.05 ml鲎试剂和0.5 EU/ml内毒素。轻轻混匀，37℃水浴25 min。(4)于S管、B管、阳性对照管中各加入鲎三肽0.05 ml;于空白管中加入鲎三肽0.05 ml和亚硝酸钠0.5 ml。轻轻混匀，37℃水浴3 min。(5)于S管、B管、阳性对照管中各加入亚硝酸钠0.5 ml，混匀。(6)在S管、B管、BB管、阳性对照管加入氨基磺酸铵0.5 ml，混匀。(7)在S管、B管、BB管、阳性对照管加入萘乙二胺0.5 ml，混匀。(8)545 nm比色。

　　1.4 检测指标 (1)将内毒素标准品稀释成不同浓度的标准品，测得相应的A值，绘制标准曲线(120 EU/ml→60 EU/ml→30 EU/ml→15 EU/ml→7.5 EU/ml→3.75 EU/ml→1.875 EU/ml→0.9375 EU/ml→0.46875 EU/ml)。(2)根据公式A=AS-(AB-ABB)，计算出标本样品A值。(3)根据样品的A值，在标准曲线上查出相应的浓度。

　　1.5 统计学分析 应用SPSS 12.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，组内比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 食管中段癌患者血浆内毒素和TNFα水平和年龄及性别的关系 血浆内毒素水平在本研究内，性别和年龄对统计结果没有影响，即性别(男、女)和年龄(>58.2岁、≤58.2岁)差异无统计学意义(P=0.296)。见表1。表1 内毒素与年龄和性别的关系

　　2.2 结扎组术前1 d内毒素水平与术后第1、3、5天内毒素水平比较 结扎组内毒素水平从术后即开始升高，第3天升至高峰，以后逐日下降，到术后第5天时，下降到和术后第1天相同的水平，并有下降到术前1天水平的趋势。未扎组术前1 d内毒素水平与术后第1、3、5天内毒素水平比较，差异有统计学意义(P<0.01)。未结扎组内毒素水平变化趋势与结扎组相同，但是未结扎组第3天开始内毒素水平下降较接扎组为慢，到第5天时仍高于术后第1天水平，但也有下降到术前1天的水平的趋势。未结扎组术后1、3、5 d与结扎组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。表2 术前和术后血浆内毒素变化注：与术前1 d比较，*P<0.01;与术后3 d比较，#P<0.01;与结扎组比较，△P<0.01

　　3 讨论

　　BT的概念于1979年由Berg所提出，指原正常存在于肠道中的活菌从胃肠道腔内转移到胃肠道外组织的现象[1]。现已明确肠道细菌移位的促发因素为：(1)肠黏膜屏障损害[2];(2)肠道菌群失调引起细菌过度增殖[3];(3)全身及胃肠道免疫功能受损。三者相互影响，促进肠道细菌移位的发生，是肠黏膜屏障的损害为主要原因。一般认为，内毒素进入肝脏后，若能逃逸枯否氏细胞的吞噬，方能进入全身血循环[4]。内毒素是革兰阴性细菌细胞壁的脂多糖(LPS)成分，类脂A是LPS的“毒力中心”。正常机体肠腔内存在大量细菌以及内毒素，正常胃肠道黏膜既能选择性的吸收营养成分，又能有效防止微生物及毒素的侵入。正常肠黏膜可允许少量内毒素通过进入门静脉，而少量内毒素对维系肝脏网状内皮系统处于轻微激活状态有一定意义[5，6]。当机体受到严重创伤、烧伤、感染、放化疗和接受长期传统肠外营养时，由于上述原因，导致内毒素移位。内毒素可以激活补体、激活凝血系统、产生刺激血管的激肽、产生激活巨噬细胞的白介素1(IL1)和恶病质素(cachectin)。当门静脉血内毒素浓度升高时，又可使肝脏免疫功能受损，同时肝脏枯否细胞吞噬内毒素后可释放一系列花生四烯酸产物及细胞因子，如前列腺素、血栓素、肿瘤坏死因子(TNF)、IL1、IL6等，引起全身多脏器损害，又可使患者对治疗的反应性降低。反过来，内毒素又可使肠黏膜通透性进一步增高，造成恶性循环，进一步加重病情。在某些情况下，尽管细菌移位可能被控制，但内毒素仍可通过受损的肠黏膜，进入血液循环，引起炎性的激活及细胞介质的释放，导致SIRS、多器官功能障碍综合征(MODS)甚至多器官功能衰竭(MOF)[7-9]。临床上，细菌感染的患者常常发生内毒素血症、弥漫性血管内凝血(DIC)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、心脏抑制等，死亡率高达20%～30%[10]。前面已经指出，细菌移位不单是指活的菌体的移位，更重要的是细菌在体内死亡解体后分解释放的内毒素的移位。公认的细菌内毒素移位的主要原因还是肠道黏膜屏障功能的损伤引起的，这种损伤在患者遭受手术创伤而且在禁食状态下更容易发生，而且SIRS的发生，只要有足够的因内毒素引起的炎性介质释放就可以发生了，因此，定量测量血浆中内毒素水平似乎更能反映大的手术创伤后SIRS的发生情况。但是，关于内毒素进入血液循环的主要途径，是以进入肠系膜淋巴结继而进入胸导管再入血为主，还是以进入门静脉再入血为主，却没有一个比较统一的结论。刘竞等[11]认为经门静脉进入肝脏的内毒素基本可被肝脏减毒，在禁食状态下，淋巴移位途径在肠源性内毒素移位中起重要作用;而Lemair[12]却认为，胸导管不是细菌内毒素移位的主要途径。目前我们认为胸中段食管癌术中预防结扎胸导管不仅能预防术后乳糜胸的发生，而且更重要的是能够减少术后禁食状态下肠道内毒素吸收入血，缩短了肠道黏膜损伤修复的时间[13，14]，降低SIRS发生的几率，为术中胸导管结扎成为常规术式提供明确的理论支持。通过内毒素水平的变化曲线可以看出，内毒素水平的变化，在手术后就开始升高，到术后第3天达到峰值，而不是象有些研究所显示的在术后24 h达到峰值。术中患者血压血氧变化、手术时间长短、术中出血量大小等，均能影响术后内毒素移位情况。说明术后经历手术创伤后，尤其是术后禁食状态下，进一步加重了肠道黏膜的损伤，肠黏膜萎缩变薄，延长了内毒素吸收入血的时间，而随着时间的推移，机体对手术创伤的应激反应和清除能力开始显现效果，从术后第3天开始，肠道黏膜的损伤开始回复，机体灭活能力加强，使内毒素吸收减少，灭活增加，内毒素水平开始下降，与相关资料基本一致[15]，到术后第5天时，内毒素下降到术后第1天的水平，并有下降到术前的趋势。这提示内毒素在手术前后的变化有一个自然过程，可能通过人为的干预改变这一过程，例如在术中保持患者血压和血氧在正常水平、缩短手术时间、术后使用保护肠道黏膜药物或者减轻炎性反应药物、早进食或者早期肠道内营养，可能会促进肠道黏膜修复，从而减少肠道内毒素移位，减少SIRS的发生率，这方面还需要进一步的研究证实。

　　【参考文献】

　　1 Andrew A.A dietary nurleosidenuceloeotide mixture inhibits，endotoxininduced bacterial translocation inmice proteinfree diet.J Nutr，1995，125：4244.

　　2 Woodman Ge,Fabian TC,Croce MA,et al.Acute ethanol intoxication and endotoxemia after trauma.J Trauma,1996,41：6163.

　　3 Llaglund U.Systemc mediators released from the gut in criticalillness.Grit Care Med，1993，21：S15.

　　4 Sato K，Yoo YC，Matsuzawa X，et al.Tolerance to the anti matastatic effect of lipopolysaccharide against liver metas tatic in mice.Int J Cancer，1996，66：98100.

　　5 朱正华.炎性免疫细胞调亡在SIRS和MODS中的作用.中国危重病急救医学,1997，11：507.

　　6 Bone RC.Immunologie dissonanee：aeontinuing evolution in our understandin go thesystemie inflammatory response syndrome (SIRS) and the multipleorgandys funtion synd rome (MODS). Ann Intern Md，1996，125：680.

　　7 任成山，毛宝龄.SIRS和MODS的研究现状与展望.中国危重病急救医学，1999,11：498501.

　　8 Davies MG，Hagen PO.Systemie inflammatory response syndrome.Br J Su，1996，84：920.

　　9 Beek DH，Taylor BL，Millar B,et al. Predietion of out eome fromintensive eare：aprospective eohort study eomparing A eute Physiology and Chronie Health Evaluation 11 and 111 Prognostie systemin a United Kingdom intensive eareunit.Critre Md，1997，25：9.

　　10 江学成.危重疾病严重程度评分临床应用和意义.中国危重病急救医学，2000，12：195.

　　11 刘竞，赵士刚.禁食后肠源性内毒素移位途径的动物实验观察.中国临床营养杂志，2001，9：233235.

　　12 Lemair.多器官衰竭患者的胸导管不是细菌移位的主要途径.国外医学创伤与外科基本问题分册,1999，22：1213.

　　13 Kohei M，Sumio W，Miyoko H，et al. Effect of epidermal growth factor and insulin on migration and proliferation of cultured rabbit epithelial cells.J Gastroenterol，1997，32：573578.

　　14 刘海霞，孟德胜.胃肠道黏膜损伤再修复研究进展.现代护理，2002，8：289.

　　15 Chung DH，Evers BM，Townsend CM，et al.Role of poly amine biosynthesis during gut mucosal adaptation after burn injury.Am J Surg，1993，165：144149.