实时荧光定量聚合酶链反应对结核性胸膜炎的诊断价值
发表时间：2011-10-11 浏览次数：588次
作者：杜秀然,李幸彬,陈素丽,刘锐,李振生 作者单位：050041 石家庄市，河北省胸科医院普胸外科
【摘要】 目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测胸腔积液结核分枝杆菌DNA对结核性胸膜炎的诊断价值。方法 对88例结核性胸膜炎患者和32例恶性胸腔积液标本行实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌DNA。结果 88例患者胸腔积液实时荧光定量PCR检测阳性36例(40.91%)，32例恶性胸腔积液实时荧光定量PCR检测阳性1例(3.13%)。2组阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.01)。结论 胸腔积液实时荧光PCR检测对结核性胸膜炎早期诊断有重要仍价值。
【关键词】 结核,胸膜炎,实时荧光定量,聚合酶链反应
结核性胸膜炎是胸腔积液的最常见原因，但其诊断主要依靠临床症状、体征、胸水实验室检查做出推测性诊断，胸水很少能发现病原菌。荧光定量PCR是一种新的基因定量检测技术，具有特异性强、灵敏度高的优点。本文应用荧光定量PCR技术检测胸腔积液中的结核分枝杆菌DNA，探讨荧光定量PCR技术对结核性胸膜炎的诊断价值。
[1] 资料与方法
1.1 一般资料 88例结核性胸膜炎患者均为我院2006年6月至2007年12月期间住院患者，其中男43例，女45例;年龄16～56岁，平均年龄(28±8)岁。根据临床表现、胸水实验室检查诊断为结核性胸膜炎，且随访经抗结核及胸腔穿剌综合治疗痊愈。对32例确诊恶性胸腔积液患者胸腔积液标本行实时荧光定量PCR检测作为对照研究。
1.2 仪器设备 达安基因股份有限公司DA7600型核酸扩增实时荧光检测系统，试剂盒为中山大学达安基因有限公司生产的结核分支杆菌核酸扩增荧光试剂盒(国药准字S20063011)。
1.3 方法
1.3.1 标本获取： 常规行胸腔穿剌术，抽取胸水放入无菌瓶中，立即封闭送检。
1.3.2 实时荧光定量PCR检测方法： 摇匀胸水，取1～1.5 ml置离心管中，12 000 r/min离心5 min。去上清，沉淀(沉淀如果不明显，可再重复离心1遍)加入无菌生理盐水1 ml震荡混匀，12 000转/min离心5 min;去上清，沉淀加入50μm DNA提取液混匀，100℃恒温处理10 min;4℃冰箱冷却至室温后，12 000转离心5 min备用。取上清液2 μm加入PCR反应管，8 000 r/min离心数秒，将反应管放入PCR仪，按下列条件扩增：93℃ 2 min预变性，然后按93℃ 45 s→55℃ 60 s先做10个循环，然后按93℃ 45s→55℃ 120 s，做30个循环。PCR反应后行荧光检测，记录读数。检测结果灵敏度下限为50拷贝。
1.4 统计学分析 应用SPSS 11.5软件对数据进行处理，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
[2] 结果
88例患者胸腔积液实时荧光PCR检测阳性36例，阳性率为40.91%，其中32例为淡黄色液体，实时荧光PCR检测拷贝数在1×102/ml～1×103/ml;4例为脓性液体，其拷贝数1×104/ml以上。32例恶性胸腔积液标本实时荧光定量PCR阳性1例，阳性率为3.13%。2组阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.01)。所有病例胸水离心沉渣涂片荧光染色镜检抗酸杆菌均为阴性。
[3] 讨论
目前结核性胸膜炎的诊断主要依靠临床症状、体征、胸水性状、实验室检查及治疗转归做出推测性诊断。文献报道[1-5]涂片查抗酸杆菌阳性率为0～13%，胸水结核分枝杆菌培养阳性率为2.94%～14.3%，可见胸水中很少能发现病原学证据。
传统PCR技术对结核性胸膜炎诊断价值的报道较多，其阳性率为35.21%～69%[1-4]，但该技术在应用中不能准确定量、容易交叉污染,产生假阳性，限制了其临床应用。实时荧光定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具有实时性和准确性等特点[6]。目前关于实时荧光定量PCR技术对结核性胸膜炎的诊断价值报道较少。
本文对88例结核性胸膜炎患者的胸腔积液行实时荧光定量PCR检测阳性36例，阳性率达40.91%，与文献[3-5]报道相近。其中4例脓胸实时荧光定量PCR检测拷贝数1×104/ml以上，远高于非脓性积液。胸腔穿剌系无菌操作，标本置于无菌瓶并迅速封闭，可排除污染的可能性。且实时荧光定量PCR反应为闭管操作，扩增过程中实时监测荧光信号的改变，不易出现假阳性。故应用实时荧光定量PCR技术检测胸水中结核分枝杆菌DNA可以为疾病提供病原学依据，有利于结核性胸膜炎的早期诊断。对32例恶性胸腔积液行实时荧光定量PCR检测阳性1例(3.13%)，考虑其原因可能为同时合并结核菌感染、或试剂、实验因素所致。如何减少假阳性率尚需进一步探讨，但采取相应措施减少标本采集过程及实验室环境污染、严格实验操作流程无疑可减少假阳率。
既往认为结核性胸膜炎的发病机制主要为结核感染引起机体迟发性变态反应。结核菌及其代谢产物进入高度过敏的机体胸膜腔引起胸膜炎症反应，胸膜毛细血管滤过性增加，静水压增加，含大分子物质的液体向胸膜腔渗出，胸腔液体中胶体压增大，胸腔液体吸收减少，形成胸腔积液。但近年发现结核性胸膜炎胸腔镜检查或开胸探查约80%患者胸膜上有结核病灶形成[7]，故目前认为结核性胸膜炎的发病是胸膜在遭受结核杆菌感染后产生针对其抗原成分的变态反应，免疫调节细胞(CD4+T淋巴细胞)在胸膜腔内募集，并分泌各类细胞因子，使效应细胞(巨噬细胞)活化，通过吞噬与杀菌作用将病原局限、消灭，同时胸膜毛细血管充血、渗出、炎症细胞浸润致胸膜通透性增高，引起胸腔积液[7]。胸水实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌DNA阳性可以从病原学上佐证这一发病机制。
通过实验可以看出实时荧光定量PCR检测胸腔积液中结核分枝杆菌DNA有助于结核性胸膜炎的早期诊断，具有重要的临床价值。
【参考文献】
[1] 肖志坚，崔秀琴，肖志敏.聚合酶链反早期诊断结核性胸膜炎的临床价值.中华结核和呼吸杂志，1995，18：196.
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[7] 严碧涯，端木宏谨主编.结核病学.第1版.北京：北京出版社，2001.576 587.
