ΔNp73基因蛋白在食管鳞癌中的表达及其临床意义

　　作者：张月峰,张云杰,李保庆,单保恩,范增林　　作者单位：050011 石家庄市，河北医科大学第四医院胸外科(张月峰、李保庆、李勇)，科研中心(单保恩);河北省磁县医院胸外科(张云杰、范增林)

　　【摘要】 目的 应用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测食管鳞癌组织中ΔNp73蛋白的表达，以探讨它与食管鳞癌的临床病理特征的关系。方法 选取2005年1月至2006年12月在我院胸外科住院手术的食管癌患者47例，制备单细胞悬液，采用间接免疫荧光标记法用ΔNp73多克隆抗体对细胞进行染色，应用FACS420型流式细胞仪进行分析。结果 食管癌组织中ΔNp73表达阳性率明显高于癌旁组织、正常组织(P均<0.01)。ΔNp73蛋白表达与食管癌浸润深度相关(P<0.05,P<0.01)，而与肿瘤大小、组织分化程度、有无淋巴结转移及TNM分期等因素无关(P均>0.05)。结论 ΔNp73基因的表达变化可能与食管癌的发生发展有关。

　　【关键词】 食管癌,ΔNp73蛋白,流式细胞术(FCM)

　　【Abstract】 Objective To detect the expression of ΔNp73 protein in esophagus squamous cell carcinoma using Flow cytometry (FCM) , and to explore the correlation between ΔNp73 and the clinical pathological characteristics of esophagus cancer .Methods A cohort of 47 cases of esophageal cancer were selected from the department of thoracic surgery, the fourth hospital of Hebei Medical University. Monoplast suspension was prepared, and the cells were immunofluorescent stained by polyclonal antibody against ΔNp73. Finally, the cells were analysed by FACS420 flow cytometer.Results The ratios of ΔNp73 positive expression in the tissues of esophageal cancer were higher than that of paracancer tissues and normal tissues (all P<0.01).The expression of ΔNp73 were correlated with the depth of caner infiltration (P<0.05; P<0.01). However, it has no correlations with size, differentiation, the status of lymph node metastasis and TNM stage (all P>0.05).Conclusion The change of ΔNp73 expression may have some correlation with the occurrence and development of esophageal cancer.

　　【Key words】 esophageal cancer; protein ΔNp73; flow cytometry (FCM)

　　近年来，对参与肿瘤发生发展及转移的各种基因的研究取得了许多成果。ΔNp73基因被认为是一种致癌基因，可以负性调控p53及全长型p73(TAp73)的功能，它在多种恶性肿瘤发生发展中起重要作用。本研究应用流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测47例食管鳞癌ΔNp73蛋白的表达，以探讨它与食管鳞癌的临床病理特征的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 选取2005年1月至2006年12月在我院胸外科住院手术的食管癌患者47例，其中男36例，女11例;年龄43～74岁，平均年龄(59±8)岁。吸烟史>400支/年23例，<400支/年24例;有饮酒史18例，无饮酒史29例;家族肿瘤史阳性17例，阴性30例;肿瘤大小：>5 cm 14例，≤5 cm 33例;分化程度：高、中分化40例，低分化7例;淋巴结转移：无转移27例，有转移20例;病理分期(按1997年UICC的TNM分期)：Ⅰ、Ⅱ期13例，Ⅲ、Ⅳ期34例。于术中离体0.5 h内取其癌组织、对应的癌旁组织(距肿瘤边缘约2 cm)和正常食管组织(距肿瘤边缘>5 cm)置入70%的乙醇固定，保存于4℃冰箱。所有肿瘤组织均经病理学确诊为鳞状细胞癌，正常食管组织经病理证实为炎症或正常鳞状上皮。全部病例术前均未行放化疗。

　　1.2 方法 留取标本经生理盐水充分冲洗后以搓网法制备单细胞悬液，采用间接免疫荧光标记法用1∶100稀释的兔抗人ΔNp73多克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司产品)对细胞进行免疫荧光染色;37℃水浴30 min，离心洗涤后加入羊抗兔PEIgG (美国Santa Cruz Biotechnology公司产品)染色，37℃水浴30 min，离心洗涤，400目筛网过滤后检测。应用美国BD公司生产的FACS420型流式细胞仪，进行单参数分析;测定数据和图形应用相应的软件程序进行资料处理。检测前以flowcheck Flouropheres(10 μm)荧光微球(REF 6605359. Beckman Coulter公司)作为标准样品调整仪器CV值在2%以下。

　　1.3 结果判定 参照Morkve等[1]提出的荧光指数(Fluorescence Index,FI)表示ΔNp73的相对含量。FI=(实验样品的荧光强度-对照样品的荧光强度)/正常食管黏膜细胞的荧光强度。定性分析以FI>1.0为阳性表达，FI≤1.0为阴性表达。

　　1.4 统计学分析 所有数据经过SPSS 13.0版统计软件进行分析处理，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料以率表示，采用χ2检验及Fisher精确检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 食管癌组织、癌旁组织及正常组织中ΔNp73蛋白的表达情况 47例癌组织中有39例(83.0%)ΔNp73蛋白表达阳性，而对应癌旁组织有15例(31.9%)表达阳性，食管正常组织中有23例(48.9%)表达阳性。癌组织阳性表达率明显高于癌旁和正常食管组织(P均<0.01);而癌旁组织中ΔNp73蛋白阳性表达率与相对应的正常食管组织进行比较，差异无统计学意义(P>0.05,χ2检验)。

　　2.2 食管癌组织中ΔNp73蛋白的表达与临床资料的关系 本研究结果显示，食管癌组织中ΔNp73蛋白表达水平与患者性别、年龄、吸烟史、饮酒史、家族肿瘤史无关。

　　2.3 食管癌组织中ΔNp73蛋白的表达与病理资料的关系 T1～2期食管癌患者与T3～4期食管癌患者的食管癌组织中，ΔNp73的表达水平分别为(1.40±0.20)和(1.14±0.33)，经统计学处理，差异有统计学意义(P<0.01)。但是，其蛋白表达水平与肿瘤大小、癌细胞的分化程度、有无淋巴结转移及TNM分期等因素无关(P均>0.05)，见表3。

　　3 讨论

　　最近研究发现，p73基因具有复杂的蛋白异构体形式，各种异构体具有不同甚至截然相反的转录活化潜能和凋亡诱导活性。缺失N末端反式激活区域的p73剪接异构体ΔTAp73的转录活化功能完全丧失，从而成为全长p73功能的显性负性因子，对p73的促凋亡功能具有拮抗的作用[2，3]。其中对ΔNp73的功能研究得最为深入。ΔNp73是缺失转录激活域的p73剪接异构体，有研究发现其对p53和p73的转录活性、介导的内源靶基因的产量及促凋亡活动均有抑制作用[4，5]，而且可以影响细胞的恶性转化过程[6]。

　　ΔNp73通过与p53竞争DNA结合部位和与TAp73直接结合，能够阻抑野生型p53和TAp73的功能，从而抑制凋亡[7，8]。

　　Stiewe等[3]发现，ΔTAp73蛋白(包括ΔNp73蛋白)的过表达可导致NIH3T3成纤维细胞的恶性转化，ΔTAp73通过引发细胞内信号串联导致细胞转化和肿瘤发生。Liu等[9]应用免疫组化技术研究发现，ΔNp73蛋白在颈部鳞状细胞癌呈过表达，明显高于正常组织，蛋白也呈过表达，且ΔNp73蛋白的表达与肿瘤的放疗敏感性呈负相关。Robert等[10]应用Western blotting方法研究发现，ΔNp73蛋白在成神经细胞瘤中过表达。本研究对47例食管癌患者ΔNp73蛋白表达的FCM分析，发现食管癌组织中ΔNp73蛋白表达FI值明显高于对应的癌旁组织和正常食管组织，说明ΔNp73蛋白在食管癌中可能起着与其他组织恶性肿瘤相似的类似癌基因的作用。

　　通过对食管癌组织中ΔNp73表达阳性的标本分析发现，食管癌浸润深度T1～2期食管癌患者在转录水平ΔNp73 FI值比相应的T3～4期食管癌患者显著增高，提示随着食管癌浸润深度的增加，ΔNp73表达水平相应降低[11]。以上研究提示，ΔNp73可能在食管癌恶性演进的早期阶段发挥着重要角色。ΔNp73表达水平与食管癌组织的大小、癌细胞的分化程度、TNM分期、有无淋巴结转移以及患者的性别、年龄、吸烟史、饮酒史、家族史等因素不存在相关性。

　　本研究还显示ΔNp73基因的表达水平与食管癌的浸润深度呈负相关。Yasuhiro等[11]报道，ΔNp73蛋白的表达与甲状腺乳头状癌的浸润深度呈负相关，这与本研究结果一致。但他们还发现ΔNp73蛋白的表达与肿瘤大小和临床转移也呈负相关。这与本研究结果不一致，笔者未发现ΔNp73表达与肿瘤大小和临床转移及其它临床病理生理特征有关。考虑其原因可能与组织特异性及样本例数大小有关。食管癌组织中ΔNp73基因表达增高的原因可能有2种情况：(1)食管癌发生过程中ΔNp73基因发生变化;(2)促进ΔNp73基因表达的因子的激活作用。国外研究者发现，ΔNp73基因可以通过与p53基因和TAp73基因竞争下游的DNA连接序列，从而对p53基因和TAp73基因功能发挥负调控作用[12]，在肿瘤细胞中ΔNp73基因发挥着一个癌基因样促进肿瘤生长的作用，可以作为一个肿瘤分子治疗的靶点。这是值得重视并需要进一步研究的问题。

　　【参考文献】

　　1 Morkve O,Laerum OD.Flow cytometic measurement of P53 portein Expression and DNA content in pareffin embeded tissue from Bronchical carcinoma.Cytometry,1991,12:438444.

　　2 Stiewe T,Theseling CC,Putzer BM.Transactivationdeficient DeltaTAp73 inhibits p53 by direct competition for DNA binding.J Biol Chem，2002，277:1417714185.

　　3 Stiewe T,Zimmermann S,Frilling A,et al.Transactivationdeficient ΔTAp73 acts as an oncogene.Cancer Res,2002,62:35983602.

　　4 Zaika AI,Slade N,Erster SH,et al.{Delta}Np73, a dominantnegative inhibitor of wildtype p53 and TAp73 is upregulated in human tumors.J Exp Med,2002,196:765780.

　　5 Pozniak CD,Radinovic S,Yang A,et al.An antiapoptotic role for the p53 family member,p73,during developmental neuron death.Science,2000,289:304306.

　　6 Frasca F,Vella V,Aloisi A,et al.p73 turersuppressor activity is impaired in humay thyrord cancer.Cancer Res,2003,63:58295837.

　　7 Ishimoto O,Kawahara C,Enjo K,et al.Possible oncogenic potential of DeltaNp73:a newly identified isoform of human p73.Cancer Res,2002,62:636641.

　　8 Zaika AI,Slade N,Erster SH,et al.DeltaNp73: a dominantnegative inhibitor of wildtype p53 and TAp73,is upregulated in human tumors.J Exp Med,2002,196:765780.

　　9 Liu SS,Chan KY,Cheng AN.Expression of {Delta}Np73 and TAp73(alpha) independently associated with radiosensitivities and prognoses in cervical squamous cell carcinoma.Clin Cancer Res,2006,12:39223927.

　　10 Robert C,Castellino,Massimiliano DB，et al.Medulloblastomas Overexpress TAp73 and {Delta}Np73.Proc Amer Assoc Cancer Res,2006,47:790798.

　　11 Yasuhiro I,Hidetaka U,Keiko F,et al.Delta Np73 expression in thyroid neoplasms originating from follicular cells.Journal Pathology,2006,38:205209.

　　12 Grob TJ,Novak U,Maisse C,et al.Human Np73 regulates a dominant negative feedback loop for TAp73 and p53.Cell Death Differ, 2001,8:12131223.