灵孢多糖对MPP+ 损伤PC12细胞的保护作用

　　作者：杨海华, 李毅， 张丹桃， 徐评议， 刘焯霖, 朱雯， 骆飞飞 作者单位：首都医科大学大兴医院神经内科， 北京 102600

　　【摘要】 【目的】 观察灵孢多糖(GLPS)对甲基-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导损伤的PC12细胞的保护作用。【方法】 将MPP+ 或GLPS加入体外培养的PC12细胞中，建立多巴胺能神经元损伤模型，用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞活力的变化;以乳酸脱氢酶(LDH)检测法检测培养上清液中LDH水平的改变;通过酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学法检测TH阳性细胞数及蛋白的表达。【结果】 MPP+处理48 h后，细胞活力降至对照组的52%，经GLPS(100、200、300 ?滋g/mL)预处理后，细胞活力明显提高，分别为65%，75%，79%(P<0.05)。MPP+处理48 h后，上清液中LDH水平较对照组明显提高，经不同浓度的GLPS预处理后，上清中LDH水平有所下降 (P< 0.05)，且TH阳性细胞数及表达强度明显高于MPP+ 组。【结论】 灵孢多糖对MPP+ 诱导损伤的PC12细胞具有保护作用。

　　【关键词】 灵孢多糖; PC12细胞; 帕金森病; 1-甲基-4苯基吡啶离子

　　帕金森病(Parkinson disease, PD)是一种好发于中老年的慢性神经系统退变性疾病，其发病机制目前尚不清楚。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)通过在体内代谢为1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP+)的形式而对多巴胺能神经元产生毒性作用[1]。大鼠的肾上腺嗜铬细胞瘤PC12株具有多巴胺能神经元的特点，被广泛用来建立PD细胞模型。近来，本实验室研究发现，灵芝孢子粉对PD大鼠模型中的多巴胺能神经元及离体原代多巴胺能神经元均有一定的保护作用[2,3]，但其有效成份及相关机制尚不清楚。灵孢多糖是灵芝孢子粉中的主要药效成分之一，具有抗炎、抗氧化等广泛的药理活性[4]。因此探讨灵孢多糖在多巴胺能神经元保护方面的作用对PD发病机制的认识及寻找新的治疗途径有重要意义。目前灵孢多糖对MPP+ 所引起的PC12的损伤是否具有保护作用，尚未见有文献报道。

　　1 材料与方法

　　1.1 药物与试剂

　　MPP+(Sigma, USA)，灵孢多糖(北京协和制药)，RPMI-1640培养基(GibcoBRL),兔抗大鼠酪氨酸羟化酶多克隆抗体 (Tyrosine hydroxylase, TH,CHEMICON )，荧光二抗FITC(DAKO公司)，MTT(博理公司)，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)检测试剂盒(南京建成)，Hepes(Gibco)，新生牛血清(杭州四季青)，马血清(Gibco)。

　　1.2 细胞及培养

　　细胞培养液为RPMI-1640，内含100 mL/L 新生牛血清、50 mL/L马血清，青霉素100 IU/mL, 链霉素100 ?滋g/mL, Hepes 0.01 mol/L,在37 ℃ 5% CO2的培养箱中培养。细胞汇集至85% 时进行传代接种。选取对数生长期细胞进行实验。

　　1.3 分组与处理

　　①空白对照组(control),在细胞培养体系中不加入任何药物; ②单纯GLPS处理组,在细胞培养体系中加入300 ?滋g/mL GLPS;③MPP+处理组,在细胞培养体系中加入MPP+;④GLPS+MPP+处理组,在细胞培养体系中加入GLPS预处理30 min，再加入MPP+ 继续处理48 h,GLPS终浓度分别为100 ?滋g/mL、200 ?滋g/mL、300 ?滋g/mL。

　　1.4 MTT法测定细胞活力

　　细胞接种于96 孔板,接种密度是1 × 105/mL,体积是200 μL/孔,每组细胞接种于8个孔中。细胞处理48 h后,收取上清，再加入培养基180 μL，每孔再加入MTT 20 μL,继续培养4 h,然后吸出培养液,加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL,振荡10 min,在酶联免疫检测仪上于570 nm波长处读取标本的吸光度,各组的吸光度与对照组的吸光度比值作为细胞的活力。每个时间点各重复上述实验一次。

　　1.5 LDH水平检测

　　用收取的96孔板中的上清进行LDH水平检测。按照试剂盒说明书进行操作。取上清液20 μL，加入基质缓冲液250 μL及辅酶溶液50 μL，混匀，37 ℃水浴15 min。加入2,4─二硝基苯肼溶液250 μL，混匀，37 ℃水浴15 min。再加0.4 mol/L NaOH 2500 μL, 440 nm 处测定吸光度。

　　1.6 TH免疫细胞组化

　　作用48 h后弃去培养基以终止细胞培养，0.01 mol/L PBS清洗一遍，吸尽PBS，40 g/L多聚甲醛室温固定20 min，PBS冲洗3次×5 min。①滴加30 g/L过氧化氢-甲醇 50 μL阻断内源性过氧化物酶，室温下湿盒孵育10 min，PBS冲洗3次×5min。②滴加100 g/L正常山羊封闭血清，室温下湿盒孵育20 min。③吸去细胞表面多余液体不洗，滴加一抗50 μL(TH 1 ∶ 100 稀释)，37 ℃孵育2 h，PBS冲洗3次×5 min;④免疫荧光染色二抗为荧光素FITC标记，室温1 h，1×PBS冲洗3次×5 min，倒置荧光显微镜观察拍照。

　　1.7 统计方法

　　采用SPSS10.0 for Windows统计软件包进行数据统计分析，正态分布资料用均数±标准差表示，统计分析采用单因素的方差分析，两两比较采用LSD法，P< 0.05差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 MTT法检测的PC12细胞活力的变化

　　不同剂量MPP+ (0～1 mmol/L) 处理后24 h ,细胞活力逐渐下降，呈剂量-依赖关系(图1)。单纯 GLPS 处理48 h 后，细胞活力与对照组比较无明显差异，说明单纯的GLPS处理对PC12细胞活力没有明显影响。单纯MPP+ (0.4 mmol/L)处理48 h 后，细胞活力明显下降，为对照组的52%， 在MPP+ (0.4 mmol/L)处理前30 min加入不同剂量的GLPS(100、200、300 ?滋g/mL)后，细胞活力较单纯MPP+ 处理组的细胞活力有明显的提高(表1，图2)。MTT检测结果提示单纯GLPS处理对PC12细胞活力无明显影响，而MPP+ 可以显著的降低细胞的活力，经过一定剂量的GLPS预处理后，细胞活力有所提高，表明GLPS对于MPP+ 损伤的PC12细胞模型具有一定的保护作用。

　　2.2 LDH活性检测

　　当MPP+ 处理后，PC12细胞膜出现损伤，胞浆中的LDH释放到培养液中，通过检测培养液中的LDH水平，可以反映出细胞的损伤程度。单纯的GLPS处理24 h后，细胞中的LDH水平较对照组无明显差异，说明GLPS对PC12 无毒性作用。MPP+ 处理48 h 后，上清DH水平较对照组明显增加，经不同浓度的GLPS预处理后，上清LDH活性较MPP+ 组明显下降(P< 0.05,表1，图3)。

　　2.3 TH免疫细胞组化检测

　　在对照组及GLPS单纯组有较多的TH阳性细胞的表达，MPP+处理后，TH阳性细胞数明显减少，表达强度减弱。但在MPP++GLPS 300 ?滋g/mL组中，TH阳性细胞数量较单纯MPP+组明显增多(图4)。

　　3 讨 论

　　灵孢多糖是灵芝孢子粉中的主要有效成分之一，具有调节免疫功能、抗肿瘤、清除自由基、抗衰老作用，且可诱导PC12细胞分化为神经元，并能明显的抑制NGF依赖的PC12细胞的凋亡[5]。在卡介苗诱导的肝损伤模型中，GLPS可抑制NO的表达，从而起到肝保护作用[6]。有研究表明灵芝多糖对于缺氧/再充氧引起的大脑皮层神经元损伤具有神经保护作用[7]。另有研究表明灵芝多糖对H2O2损伤的PC12细胞具有保护作用[8]。本实验室近来研究表明灵芝孢子粉对PD大鼠模型有一定的保护作用[2]，但其有效成份尚不明确。灵孢多糖是灵芝孢子粉中的主要成份之一，因此我们推测灵孢多糖对于PD有一定的保护作用。目前尚无报道表明GLPS对MPP+ 诱导损伤的PC12细胞是否具有保护作用，因此本实验通过MPP+ 诱导的PC12细胞建立多巴胺能神经元细胞模型，在离体的细胞培养中观察GLPS是否具有保护作用。

　　MPP+作为MPTP 的活性代谢物，它是线粒体复合物Ⅰ的抑制剂，可诱导PC12 细胞线粒体功能障碍和氧自由基生成增加，最后导致细胞凋亡/坏死[9,10]。有研究表明PC12细胞在低糖条件下，易受MPP+ 的损伤，呈剂量及时间依赖关系，在高糖条件下MPP+ 对PC12细胞无明显影响[11]。在本实验中也观察到在低糖条件下随着MPP+ 浓度的增加，细胞活力逐渐下降。

　　在本实验中，通过MTT及上清中LDH活性的检测来观察GLPS对MPP+ 诱导损伤的PC12的保护作用。经一定浓度的GLPS预处理后，细胞活性较单纯MPP+ 处理组的细胞活性有明显的提高，且上清中LDH的水平也显著下降。TH细胞免疫组化也发现，GLPS处理组的阳性细胞数及其表达强度较单纯MPP+ 组的TH阳性细胞数及表达强度有明显提高。这些结果表明，GLPS对于MPP+ 损伤的PC12具有一定的保护作用，可望用于神经系统变性疾病PD的治疗。

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