脂质体介导的VEGFC反义寡核苷酸对肺腺癌细胞系 A549生长、凋亡的影响

　　作者：郭旭峰 徐中华 陈勇兵 杨文涛 徐忠恒 钱永跃 作者单位：苏州大学附属第二医院胸心外科，江苏 苏州 215004

　　【摘要】目的 探讨脂质体介导的血管内皮生长因子C(VEGFC) 反义寡核苷酸对肺腺癌细胞系 A549生长、凋亡的作用。方法 将 A549 细胞随机分为磷酸盐缓冲液对照组(PBS组)、正义寡核苷酸对照组(SODN组)和反义寡核苷酸转染组(AODN组),应用细胞计数方法计数每组细胞数，苏木精伊红(HE)染色法观察细胞形态及分布，流式细胞仪分析A549细胞凋亡情况。应用Western印迹方法检测转染后各组A549细胞中VEGFC蛋白表达。结果 VEGFC反义寡核苷酸转染后，AODN组细胞生长受抑程度显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，生长缓慢且核分裂像较对照组明显减少。流式细胞仪检测结果显示AODN组细胞凋亡率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。Western印迹结果显示VEGFC反义寡核苷酸可明显抑制VEGFC基因表达。结论 脂质体介导的VEGFC反义寡核苷酸能有效地干扰VEGFC基因表达,并可抑制肺腺癌A549细胞生长并促进其凋亡。

　　【关键词】 肺癌;反义寡核苷酸;凋亡

　　随着对非小细胞肺癌(NSCLC)综合治疗和个体化治疗的认识不断加深和推广，NSCLC的治疗已经有了很大进展，但目前NSCLC的5年生存率仍低于15%。肺癌早期即可发生淋巴结转移是导致其预后极差的主要原因之一。我们前期研究结果已经证实NSCLC通过高表达VEGFC与淋巴管内皮细胞VEGFR3特异性结合刺激肺癌新生淋巴管生成，从而促进肺癌细胞的增殖和转移〔1〕。为探讨以VEGFC为靶标进行反义基因治疗的可行性,本实验应用脂质体介导的VEGFC反义寡核苷酸转染肺腺癌A549细胞,观察其对A549细胞生长、凋亡的影响，寻找肺癌基因治疗新方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　肺腺癌 A549细胞株由山东大学齐鲁医院胸外科胡国强教授惠赠，生长特性为贴壁生长，传代培养。RPMI 1640培养基购自Gibco公司，胎牛血清系杭州四季青产。全硫代磷酸化修饰的寡核苷酸均由上海生工公司合成，VEGFC反义寡核苷酸序列为5′CCCACATCTGTAGAGGGAGGACTC3′，正义寡核苷酸序列为5′TACGTAGTATGGTGTACGATC3′。兔抗人多克隆抗体VEGFC购自北京中山生物技术公司。

　　1.2 实验分组

　　取对数生长期A549细胞，以1×105/孔接种至6孔板，待其生长至90%融合时，用Lipofectamine 2000脂质体介导，将AODN、SODN转染到A549细胞内，SODN组以4 μg/ml浓度转染，AODN组设计2种浓度：4、8 μg/ml，分别于转染24及48 h后终止。以等体积磷酸盐缓冲液代替寡核苷酸转染作为阴性对照组(PBS组)。

　　1.3 A549细胞形态学观察

　　根据实验时相，95%的酒精固定5～10 min后，行HE染色后自然晾干，在油镜下观察A549细胞的形态特点及各时相细胞形态的变化。

　　1.4 A549细胞生长特性观察

　　胰酶消化收集6孔板中的细胞，进行准确的细胞计数，绘制细胞生长曲线。

　　1.5 流式细胞仪观察A549细胞周期时相分布及凋亡率

　　每个实验组各时相的细胞计数完毕、收集后，离心5 min(800 r/min)，PBS洗1次，1%多聚甲醛固定后，用PBS再洗2次，加碘化丙锭(PI)0.5 ml，避光反应20 min，上机检测，仪器同时测定DNA荧光强度及散射光参数，并用随机软件CELL Quest定量细胞凋亡数目及细胞周期分布。

　　1.6 VEGFC蛋白的检测

　　对生长在含5%胎牛血清的RPMI 1640培养基中的A549细胞,VEGFC反义寡核苷酸转染,48 h后提取细胞蛋白,Western印迹检测VEGFC基因表达。同时检测βactin的蛋白表达量作为内参照。

　　1.7 统计学方法

　　应用 SPSS13.0 软件包进行方差分析。

　　2 结果

　　2.1 VEGFC反义寡核苷酸对 A549细胞生长、凋亡的影响

　　人肺腺癌细胞A549在应用脂质体介导的VEGFC反义寡核苷酸转染后，从12 h开始，细胞生长明显受抑，且呈浓度依赖性，以8 μg/ml浓度时受抑最强(P<0.01)，SODN组和PBS组A549细胞的受抑制作用转染前后无显著性差异(P>0.05)。经HE染色后，镜下见转染前A549细胞生长旺盛，胞核大，核仁多且核分裂明显，细胞棘突多而长，相互间连接紧密。转染后，SODN组和PBS组A549细胞生长无明显变化，AODN组A549细胞在培养12 h后生长明显受抑，胞核变小，核分裂像明显少见，见图1。流式细胞仪检测结果显示 A549细胞自转染后12 h起，AODN组细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0.01)，且8 μg/ml组凋亡率也明显高于4 μg/ml组(P<0.05)，呈现浓度依赖关系，见图2。

　　2.2 Western印迹检测转染后A549细胞中 VEGFC蛋白表达

　　VEGFC反义寡核苷酸转染的A549细胞VEGFC蛋白表达量明显降低,与SODN组和PBS组相比较有显著性差异(P<0.05)，见图3。

　　箭头所示核分裂

　　3 讨论

　　随着分子生物学技术的不断提高，针对特意靶分子的反义基因治疗在癌症治疗中显示出巨大的前景。VEGFC是迄今惟一特异性淋巴管内皮细胞刺激因子，它通过诱导微淋巴管的生成并影响淋巴管内皮的通透性,从而促进肿瘤转移〔2〕。肿瘤的淋巴管生成是指在肿瘤原位形成新的毛细淋巴管。与毛细血管相比较，新生淋巴管仅由单层淋巴内皮细胞组成、基底膜不完整、管壁薄、流速缓慢、剪切力低及淋巴与组织间液的组成基本相同，因而更有利于肿瘤细胞进入淋巴管道，进而形成淋巴转移和远处转移〔3，4〕。针对VEGFC可刺激肿瘤新生淋巴管生成的功能和机制，以VEGFC为靶标进行肿瘤的反义基因治疗正成为研究的热点。国外多项研究表明〔5，6〕,抑制VEGFC蛋白的活性和表达量,可减缓肿瘤细胞的生长和转移。Roberts等〔5〕研究发现特异性VEGFR3抗体能有效抑制VEGFR3的活性，从而抑制肿瘤细胞局部和远处淋巴结转移。Lin等〔6〕在研究前列腺癌淋巴结转移时发现利用重组腺病毒诱导载体携带着可溶性VEGFR3免疫球蛋白可有效抑制前列腺癌淋巴结转移。

　　本研究提示VEGFC反义寡核苷酸可有效抑制肺癌细胞的生长。我们在油镜下观察到VEGFC反义寡核苷酸转染后，SODN组和PBS组A549细胞生长无明显变化，而AODN组A549细胞生长较转染前明显受抑，胞核变小，核分裂像明显少见，从形态学上确实证明了VEGFC反义寡核苷酸对肺癌细胞生长的抑制作用。AODN组细胞出现更为明显的凋亡。因此,我们认为诱导细胞凋亡是VEGFC反义寡核苷酸抑制肺癌生长的机制之一。此外，我们从蛋白质水平证实了VEGFC反义寡核苷酸对肺癌细胞生长的抑制作用。

　　综上所述,脂质体介导的VEGFC反义寡核苷酸能减少VEGFC基因表达,抑制肺癌A549细胞的生长并诱导其凋亡,有望成为肺癌有临床应用价值的反义基因治疗药物。

　　【参考文献】

　　1 郭旭峰，胡国强，尹秋伟，等.PTTG、VEGFC基因过表达与非小细胞肺癌发生、发展的关系及其临床意义〔J〕.山东大学学报(医学版),2006;44：11759.

　　2 David G.New molecular markers for the study of tumor lymphangiogenesis〔J〕.Anticancer Res，2001;21(6B):427983.

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　　4 Ishikawa M，Kitayama J，Kazama S,et al.Expression of vascular endothelial growth factor C and D(VEGFC and D)is an important risk factor for lymphatic metastasis in undifferentiated early gastric carcinoma〔J〕. Jpn J ClinOncol,2003;33(1):217.

　　5 Roberts N，Kloos B，Cassella M,et al.Inhibition of VEGFR3 activation with the antagonistic antibody more potently suppresses lymph node and distant metastasis than inactivation of VEGFR2〔J〕.Cancer Res,2006;66(21):26507.

　　6 Lin J，Lalani AS，Harding TC,et al.Inhibition of lymph node metastasis using adenoassociated virusmediated gene transfer of a soluble VEGFR3 decoy receptor〔J〕.Cancer Res，2005;65(6):69019.