香烯对人肺腺癌SPC-A-1细胞VEGF-C及VEGFR-3表达的影响

　　作者：周昆 崔黎 闫焱 刘红 赵松 陈奎生 作者单位：郑州大学第一附属医院胸外科，河南 郑州 450052

　　【摘要】目的 探讨榄香烯对体外培养的人肺腺癌SPC-A-1细胞株血管内皮生长因子(VEGF-C)及其受体VEGFR-3表达水平的影响。方法 采用免疫细胞化学方法对药物作用后的SPC-A-1细胞VEGF-C、VEGFR-3的表达水平进行检测。结果 榄香烯能明显抑制肺腺癌SPC-A-1细胞的生长并降低VEGF-C、VEGFR-3的表达水平，而且有时间和浓度依赖性。结论 榄香烯通过降低肺腺癌细胞VEGF-C、VEGFR-3的表达水平，从而遏制了肿瘤血管、淋巴管转移。

　　【关键词】 榄香烯; 肺癌细胞株;血管内皮生长因子; 免疫细胞化学

　　榄香烯(Elemene)是从中药温莪术(Gurcurma Wenyujin Y.HCHEN)的挥发油中提取的抗癌活性成分〔1〕，经红外、核磁共振和质谱鉴定证实有效成分为β-榄香烯(β-elemene)〔2〕,该药毒副作用小，无骨髓抑制作用，具有广泛的临床应用前景〔3，4〕。本实验采用细胞化学方法检测体外培养人肺腺癌SPC-A-1细胞株在不同浓度榄香烯作用下表达血管内皮生长因子(VEGF-C)及其受体VEGFR-3的水平，旨在探讨榄香烯在分子水平的抗癌机制，为临床应用提供理论基础和实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料和主要试剂 榄香烯乳注射液(大连金港制药公司);人肺腺癌SPC-A-1细胞株由上海中国生命科学院细胞库提供;改良型 RPMI 1640细胞培养基(含双抗)〔海克隆生物化学制品(北京)有限公司〕;胎牛血清(天津海林生物技术有限公司);胰蛋白酶(吉诺生物制品公司);VEGF-C、VEGFR-3单克隆抗体(工作浓度1∶100)(北京中杉金桥生物制品公司);免疫细胞化学ABC检测试剂盒(福州迈新公司);DAB显色试剂盒(北京中山生物技术公司)。

　　1.2 主要仪器 Olympus BH-2型双目显微镜(日本Olympus公司)，电热手提式压力蒸汽灭菌器(上海医用核子仪器厂)，CO2培养箱(NAPCO 产品，Model 5410)，超净工作台(上海净化设备厂)。25 cm2、75 cm2培养瓶、24 孔培养板(FALCON 产品)，微量移液枪2.5 μl、10 μl、100 μl、1 000 μl(Eppendorf 产品)，倒置显微镜及显微照相仪(日本Olympus公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 分组 共分8组，20、40、60、80、100 mg/L榄香组及3 mg/L顺铂组、空白组、PBS阴性对照组，不同浓度的榄香烯由5 mg/L榄香烯原液用1640培养液分别稀释而成。各组均抽取十张载玻片进行观察。

　　1.3.2 细胞培养及爬片 SPC-A-1细胞按常规复苏，置 37℃，5%CO2培养箱中培养。每2～3 d换培养液一次，RPMI 1640培养液(含双抗)中含 10%胎牛血清。4～5 d细胞长满培养瓶底80%～90%时用毛细吸管吸出培养液，加入PBS液冲洗，然后加入1 ml 0.25%胰蛋白酶常温消化，时程以镜下观察细胞收缩变形为止，终止消化。转移入10 ml离心管1 000 r/min离心5 min。把4 cm×4 cm的盖玻片(已高温消毒)平铺于24孔培养板底备用(24孔培养板置紫外灯下照射过夜)。 吸出上层液体加培养液吹打均匀，制备成单细胞悬液，传至24孔放有盖玻片培养板中，每瓶加细胞悬液1 ml，加培养液1 ml(含 10%胎牛血清)，37℃ 5%CO2培养箱中培养 24 h，当电镜下观察到细胞贴壁生长时，分别加入200 μl不同浓度的榄香烯注射液及顺铂、PBS，空白组加入1640培养液。

　　1.3.3 结果判断标准 按照免疫细胞化学ABC法进行实验，结果判定标准如下：

　　1.3.3.1 VEGF-C、VEGFR-3染色强度 标准1：按照胞浆染色着色深浅打分，无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，深褐色为4分。标准2：按照阳性细胞率打分，阴性为0分，0～10%为1分，10%～50%为2分，>50%为3分。

　　1.3.3.2 VEGF-C、VEGFR-3 表达强度 表达强度=标准1×标准2，0～2分为(-)，3～4分为(+)，5～7分为()，8～9分为()。

　　1.3.3.3 VEGF-C、VEGFR-3阳性指数 低倍镜下分别选取VEGF-C(+)癌细胞、VEGFR-3(+)癌细胞最密集区，然后100倍视野下随机选取10个视野，计出细胞总数和阳性表达细胞数，阳性指数=阳性表达细胞数/细胞总数。

　　1.3.3.4 VEGF-C、VEGFR-3 蛋白含量 蛋白含量=标准2×阳性指数

　　1.4 统计学方法 采用SPSS10.0统计分析软件，多个样本之间两两比较采用单因素方差分析(SNK)。

　　2 结果

　　2.1 细胞形态及生长状况 ①空白组、PBS阴性对照组SPC-A-1细胞生长状况良好：细胞贴壁生长旺盛，细胞间结构紧密，呈铺路石状。细胞轮廓清楚，胞浆饱满均质透明，核浆比例较大。②不同浓度榄香烯、顺铂对SPC-A-1细胞形态及生长的影响：细胞生长增殖受到抑制，细胞贴壁能力下降。形态不规则，体积变小变圆，细胞结构不清，胞膜皱褶，核固缩，核浆比例减小，细胞质中颗粒增多，核边聚伴有碎裂。

　　2.2 不同浓度榄香烯、顺铂对VEGF-C、VEGFR-3蛋白表达的影响 结果显示，两种蛋白阳性染色表达均定位于细胞浆，空白组和PBS阴性对照组中两种蛋白均有较强的表达，呈棕黄色染色。榄香烯对SPC-A-1细胞抑制作用随药物作用浓度的增高和作用时间的延长而增强，两种蛋白的表达水平逐渐下降。榄香烯(60、80、100 mg/L)组和顺铂(3 mg/L)组与榄香烯40 mg/L和PBS阴性对照组、空白组两种蛋白的表达水平比较在不同时间点均有显著性差异(均P<0.05);不同时间点顺铂(3 mg/L)组与榄香烯(60、80 mg/L)组之间比较均有显著差异(均P<0.05);两种蛋白的表达水平在药物作用组与空白组之间有显著性差异(P<0.05)。各组不同时间点(除g、h组)之间两种蛋白表达水平比较均有显著性差异(均P<0.05)，且随时间延长两者表达水平下降(见表1)。

　　表1 不同浓度β-榄香烯乳作用人肺腺癌SPC-A-1细胞6 h、12 h和24 h后VEGF-C、VEGFR-3蛋白表达含量(略)

　　6 h、12 h、24 h三个时间点两者a组与b组比较：1)均P>0.05，c、d、e、f组与a、b、g组比较：2)均P<0.05，f组分别与c、d组比较：3)均P<0.05，各组不同时间点两者表达水平比较(除g、h组外)：4)均P<0.05，c、d、e、f组随作用时间的增加两者表达水平比较：5)均P<0.05，6)h组未检测出阳性结果,说明一抗作用明显

　　3 讨论

　　众所周知，淋巴道转移和血行转移是肿瘤最常见的转移途径，也是影响患者术后肿瘤复发及长期生存率的重要因素，血管生成是肿瘤生长和转移的关键这一观点已被广泛接受〔5〕。在局部缺乏血管生成的情况下，肿瘤的生长不能超过2 mm2。近年的研究也发现淋巴管生成与肿瘤转移亦有相关性。所以，研究血管生成和淋巴管生成的机制对于肿瘤的治疗至关重要。Joukov等〔6〕(1996)利用受体亲和色谱法从人类前列腺癌细胞株PC-3的cDNA文库中克隆并分离出VEGF/PDGF家族的一个新成员VEGF-C，也分离出了相应的基因，并将此基因编码的蛋白质命名为血管内皮生长因子相关蛋白(vascular endothelial growth factor-related protein)。近年来研究发现VEGF-C可诱导实体瘤内或瘤周的淋巴管生成和/或淋巴管扩张，与恶性肿瘤的淋巴道转移密切相关〔7，8〕。在已经研究的肿瘤中,大约有1/2的肿瘤细胞表达VEGF-C,如:甲状腺癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌等。VEGF-C不仅可以通过VEGFR-2诱导肿瘤血管生成,还可以通过VEGFR-3诱导肿瘤外周形成新的淋巴血管,促进癌细胞通过淋巴血管转移到淋巴结。同时VEGF-C还促进肿瘤生长,在癌细胞脱离基质以及到达转移部位时抑制凋亡，这就使得VEGF-C成为控制肿瘤生长转移以及治疗肿瘤的一个新的理想的靶点〔9〕。作为VEGF-C受体的VEGFR-3与之结合后，活化诱导两个重要的生存和增殖信号分子发生磷酸化：p42/p44丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB或Akt) 〔10〕。MAPKs的下游是MAPK活化激酶，能够使转录因子环腺苷酸(cAMP)反应元件结合蛋白(CREB)发生磷酸化，通过增加生存基因的转录促进细胞生存。Akt是磷酯酞肌醇-3激酶(phosphatidylinositide3′-kinase，PI-3K)信号通路的下游信号。活化的Akt参与调节许多底物的作用，包括细胞生存、细胞周期进展和细胞增殖的调控，而VEGF-C能够刺激人类皮肤的微管内皮细胞内的Akt发生磷酸化。 VEGFR-3的信号刺激通过以上两条重要的信号通路转导保护淋巴细胞免于血清来源诱导的凋亡，并促进淋巴内皮细胞的增殖和迁移〔11〕。由此可见，VEGF-C、VEGFR-3这两种因子在肿瘤的血行转移和淋巴道转移中起关键性作用。目前，化疗药物治疗肿瘤主要是通过对肿瘤细胞的生长抑制和致细胞凋亡而发挥效应，在众多化疗药物中榄香烯是从中药成分温莪术中提取的具有抗癌作用的国产新药。

　　近年来，已有大量研究证实该药能较好的抑制肿瘤细胞的生长、增殖，能诱导细胞凋亡，并对肿瘤细胞具有免疫作用〔12～14〕。同时，该药毒副作用小，无明显肝、肾功能损伤，不发生骨髓抑制〔15〕。本研究表明不同浓度榄香烯对肿瘤细胞SPC-A-1中VEGF-C及VEGFR-3蛋白水平起下调作用，从分子水平对榄香烯抗肿瘤机制又作以补充，说明榄香烯还可以通过下调血管生长因子及其受体来遏制肿瘤的血行转移及淋巴道转移。此结果也为肺腺癌临床靶向治疗提供了理论基础和实验依据。

　　【参考文献】

　　1 钱 军，秦叔逵，杨爱珍，等.榄香烯乳对体外培养人肺癌细胞株超微结构的影响〔J〕.临床肿瘤学杂志,1997;2(1):49-51.

　　2 傅乃武，全兰萍，时继慧，等.β-榄香烯的抗肿瘤作用和药理学研究〔J〕.中药理论、药理与临床,1984;9(2):35-9.

　　3 周 定.榄香烯乳加VP及VP治疗晚期非小细胞肺癌随机对比观察〔J〕.中国肿瘤临床,2001;28(6):470-1.

　　4 徐培玉，许仲聪，陈路川，等.榄香烯乳对表浅性膀胱癌治疗和预防术后复发的观察〔J〕.中国肿瘤临床,2001;28(1):50-2.

　　5 Ellis LM，Fidler IJ.Angiogenesis and metastasis〔J〕.Eur J Cancer，1996;32(14):2451-60.

　　6 Joukov V，Pajusola K，Yuan J,et al.A novel endothelial growth factor，VEGF-C，is a ligand for the Flt4(VEGFR-3) and KDR(VEGFR-2) receptor tyrosine kinases〔J〕.EMBO J，1996;15(2):290-8.

　　7 Mandriota SJ，Jussila L，Jeltsch M,et al.Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis〔J〕.EMBO J,2001;20(4):672-82.

　　8 Enholm B,Jussila L，Karkkainen M,et al.Vascular endothelial growth factor-C：a growth factor for lymphatic and blood vascular endothelial cells〔J〕.Trends Cardiovasc Med,1998;8(3):292-7.

　　9 Zhang X，Wang JF，Chandran B,et al.Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus activation of vascular endothelial growth factor receptor 3 alters endothelial function and enhances infection〔J〕.J Biol Chem,2005;280(28):26216-24.

　　10 Makinen T，Veikkola T，Mustjlki S,et al.Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth，survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3〔J〕.EMBO J,2001;20(17):4762-73.

　　11 He Y，Kozaki K，Karpanen T,et al.Suppression of tumor lymphangiogenesis and lymph node metastasis by blocking vascular endothelial growth factor receptor3 signaling〔J〕.J Natl Cancer Inst,2005;94(11):819-25.

　　12 吴伟忠，刘康达，汤晓雷，等.β-榄香烯注射液诱导的抗肿瘤免疫保护作用机理初探〔J〕.中华肿瘤杂志，1999;21(6)：405-40.

　　13 Zhao WH，Shi GX，Yuan XL,et al.Immunotherapeutic effects of elemene combo tumour cell vaccine on Hca-F changes of IL-10 and IL-12 secretion by splenocytes of treated Mice〔J〕.Chin J Cancer Biother，2001;8(2)：126-9.

　　14 Fan ZZ，Sun Y,Li Q,et al.The research of elemene injection inducing pancreatic cancer BxPC-3 cell withering and blocking the cell′s cycle in human being〔J〕.Chin Med J,2005;3(22)：1 5831-6.

　　15 周洪语.榄香烯抗肿瘤作用机制的研究进展〔J〕.中国肿瘤临床,2000;27(5)：392-4.