核酸疫苗免疫帕金森病小鼠的治疗作用

　　作者：王少君　王加才 欧阳松应 彭国光 罗琴 涂文斌 江思德 徐芙蓉 作者单位：重庆医科大学附属第一医院神经内科 重庆市神经病学重点实验室,重庆 400016　1 中铁二十局中心医院(延安大学医学院第三附属医院)神经内科2 中国科学院生物物理研究所

　　【摘要】目的 探讨α突触核蛋白(αsynuclein，αsyn)核酸疫苗免疫对MPTP慢性帕金森病(PD)小鼠的治疗效果。方法 将该实验室成功构建的αsyn核酸疫苗pVAX1hαSyn84140用Qiagen试剂盒大量制备αsyn质粒;24只MPTP慢性PD小鼠随机分为3组：疫苗组、空质粒对照组和PBS对照组，各组小鼠分别肌注pVAX1hαSyn84140重组质粒，pVAX1空质粒和PBS各100 μl，共免疫3次，每次间隔3 w，末次免疫后2 w，观察小鼠行为学变化及中脑黑质αsyn表达和多巴胺能神经元数目变化。结果 pVAX1hαSyn84140核酸疫苗免疫组小鼠的类PD样症状与空质粒和PBS对照组相比显著减轻(P<0.01);小鼠中脑黑质αsyn表达较对照组减少约30%(P<0.01) ，且多巴胺能神经元数目较空质粒和PBS对照组增多了31%～39%(P<0.01)。结论 pVAX1hαSyn84140核酸疫苗具有较强的免疫原性，能对帕金森病小鼠产生较好的免疫治疗作用。

　　【关键词】 帕金森病 α 突触核蛋白 核酸疫苗

　　60岁以上人群中，帕金森病(PD)患病率为1%，严重危害中老年人的身体健康。PD确切的病因和发病机制迄今尚未明确，目前主要是以左旋多巴为主的对症治疗，尚无根本性的治疗方法。PD主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元严重缺失和残存神经元内出现嗜酸性包涵体——Lewy小体。而异常聚集的α突触核蛋白(αsynuclein，αsyn)是Lewy小体的主要成份，近年研究表明αsyn在PD发病中起了重要的作用，以αsyn为靶点进行PD防治研究极具潜力〔1，2〕。核酸疫苗是近几年免疫学和分子生物学研究的新兴领域，其免疫效果可靠持久、免疫应答全面，且性状稳定，造价低廉，易于制备，与传统疫苗相比具有很大优越性。本研究首次将αsyn核酸疫苗pVAX1hαSyn84140质粒直接肌注MPTP慢性PD小鼠，观察其免疫治疗效应。

　　1 材料与方法

　　1.1 αsyn质粒疫苗

　　αsyn质粒pVAX1hαSyn84140核酸疫苗为去除了αsyn毒性片段序列，保留其有效抗原表位的αsyn基因片段真核表达载体，由本实验室成功构建和制备。真核表达载体pVAX1由Invitrogen公司购进，大肠杆菌TOP10为本室保存。

　　1.2 主要试剂

　　无内毒素核酸纯化试剂盒(Qiagen德国);1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶(1methyl4phenyl1,2,3,6tetrahydropyridine，MPTP)、丙磺舒(Sigma美国);鼠抗酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)单克隆抗体、绵羊抗αsyn多克隆抗体(Chemicon)，生物素化抗小鼠二抗(深圳晶美)，生物素化抗绵羊二抗(VECTOR)，免疫组化检测试剂盒由深圳晶美生物公司购进，其他常规试剂均为国产分析纯。

　　1.3 实验动物

　　清洁级C57BL/6小鼠24只,雄性，6～8周龄，18～22 g，由重庆医科大学实验动物中心提供。

　　1.4 质粒的大量制备及纯化

　　按Qiagen质粒纯化试剂盒说明书大量制备无内毒素质粒pVAX1hαSyn84140和pVAX1两种质粒，用灭菌的PBS溶液溶解，用分光光度计测定A260/A280比值以确定核酸样品的纯度，其比值为1.836，用灭菌的PBS溶液调整浓度至1.0 μg/μl，贮于-20℃ 备用。

　　1.5 MPTP慢性PD小鼠模型的建立

　　雄性6～8周龄 C57BL/6小鼠24只，参考Meredith等〔3〕文献的模型,制作MPTP慢性PD小鼠模型。给予模型组小鼠背部皮下注射MPTP(25 mg·kg-1·次-1)和丙磺舒(250 mg·kg-1·次-1),2次/w,连用5 w。

　　1.6 实验动物的DNA免疫

　　24只MPTP慢性PD小鼠接种前3 d，双侧后肢胫骨前肌接种部位分别注射0.5%布比卡因50 μl，然后随机分为3组(每组8只):疫苗组、空白质粒对照组和PBS对照组，各组小鼠分别肌注pVAX1hαSyn84140重组质粒、空白质粒pVAX1和PBS溶液100 μl，共免疫3次，每次间隔3 w，最后一次免疫后2 w杀鼠取脑。

　　1.7 免疫后小鼠行为学变化观察

　　在免疫接种的全部过程中及杀鼠取脑前1 d，密切观察并记录各组小鼠的行为学变化并在杀鼠前1 d进行爬杆实验记录时间，共5次，取其平均值。

　　1.8 小鼠中脑黑质αsyn 和TH 变化的观察

　　采用升主动脉灌注固定法灌注脑组织，留取脑组织乳头体中下部及桥脑上1/4，石蜡包埋，切片，片厚5～6 μm。免疫组化染色：石蜡切片常规脱蜡至水，体积分数为0.3%的H2O2去除内源性过氧化物酶;抗原微波修复后，滴加封闭液，室温孵育20 min以阻断非特异性IgG;相继滴加特异性第一抗体(TH一抗1∶400稀释，αsyn一抗1∶1 000稀释)及特异性生物素化第二抗体(二抗为工作液)，均过夜，二氨基联苯胺显色，苏木精复染，盐酸乙醇分色。阳性细胞胞浆被染成棕黄色，核呈蓝色。每张切片随机选取10个高倍视野(×400)进行图像分析，测量免疫组化染色的积分光密度值和阳性细胞数。

　　1.9 统计学处理

　　数据用x±s表示，并采用SPSS12.0软件包进行数据分析，作单因素方差分析(oneway ANOVA)检验，组间比较用LSD检验。

　　2 结 果

　　2.1 行为学观察

　　与对照组比较，疫苗组小鼠的自发性活动减少，爬行活动缓慢，对外界刺激不自主竖毛，逃避反应慢等类PD症状改善;疫苗组小鼠爬杆时间〔(6.37±0.247)s明显少于空质粒组及PBS对照组〔(7.51±0.314)s,(7.54±0.389)s〕(F=34.441,P<0.01)。

　　2.2 中脑黑质αsyn表达改变

　　疫苗组小鼠中脑黑质部αsyn阳性细胞染色较浅，积分光密度值为1 756.91±20.562,而空质粒组及PBS对照组脑黑质积分光密度值分别为2 522.22±31.006,2 548.51±34.948;与空质粒组及PBS对照组相比，疫苗组减少约30%(F=1 862.22,P<0.01)，而空质粒组和PBS组中脑黑质积分光密度值无显著差异(P>0.05),表明疫苗组αsyn表达较对照组减少(图1)。

　　2.3 中脑黑质TH表达变化

　　见图2。空质粒组和PBS组中脑黑质TH阳性细胞胞浆染色较浅，突起较少，细胞数明显减少，分别为21.00±2.507，19.75±2.121,两组之间无显著差异(P>0.05)，而疫苗组TH阳性细胞为27.50±2.449,较空质粒组和PBS组TH阳性细胞增多、染色加深,阳性细胞数与空质粒组及PBS对照组比较增加了31%～39%，且有显著差异(F=24.753,P<0.01)。

　　3 讨 论

　　近年来，蛋白质异常聚集在神经变性疾病发病机制中的重要作用日益受到重视。Carrel等1997年首次系统性提出构象病的概念从分子水平来解释许多具有相似发病机制的疾病如阿尔茨海默病、PD、路易体病、朊蛋白脑病及亨廷顿病等〔4〕。蛋白质误折叠和构象变化是构象病发生和进展的主要原因。细胞毒性的蛋白质聚集体形成(目前认为形成寡聚化的聚集体更具有细胞毒性)是构象病显著的共同特征,以异常聚集和误折叠的蛋白质为靶点进行神经变性疾病的治疗成为研究的热点〔5〕。

　　αsyn是PD发病机制中最重要的蛋白，它是PD病理标志——Lewy小体的主要结构成分。近年来越来越多的研究表明αsyn异常聚集与PD的发病密切相关〔6〕。αsyn基因突变(A53T,A30P，E46K)及2个与αsyn降解有关的基因(泛素C末端水解酶、Parkin)突变可引起αsyn在细胞内异常蓄积聚合,已被确定为家族性PD的主要原因。研究也显示αsyn转基因小鼠与果蝇模型具备PD的许多重要特征〔7〕。而目前研究认为αsyn聚集过程中形成的寡聚体可与细胞膜结合，具有较强的细胞毒性,可在PD的发病过程起重要作用〔8〕。所有这些结果均表明αsyn在PD的发病机制中起非常重要的作用，并且很可能是PD发生发展的一个中心环节。因此以αsyn为靶点进行PD的疫苗治疗是一个崭新的研究方向。对于PD疫苗治疗的研究，国内外报道甚少，2005年Mosliah等首次用αsyn重组蛋白疫苗免疫PD转基因小鼠,取得了较好的效果〔9〕。而核酸疫苗技术其最大优点是可以通过内源性抗原递呈系统,诱发机体特异性体液免疫和细胞免疫,以达到预防和治疗疾病的目的。与传统疫苗相比有许多优点：免疫反应特异、全面，免疫效应持久;与重组蛋白质相比,核酸疫苗产生的抗原蛋白的空间构象与天然蛋白更接近,更接近自然感染状态,免疫原性更强;且成本低廉,制作工艺简单,稳定性好,易保存,运输储存方便，已在多种疾病的防治中显示出巨大的应用潜力〔10〕。以αsyn核酸疫苗进行PD的治疗研究极具前景。

　　αsyn是由140个氨基酸组成的相对分子质量为18 000～20 000的蛋白质，氨基酸序列由三部分组成：N末端重复区、NAC区和酸性C末端区。N末端重复区大约由65个氨基酸组成，在αsyn的聚集中起重要作用，αsyn突变中A53T,A30P及E46K均发生于该区段;NAC区由61～95位氨基酸组成，是αsyn序列中疏水性最强的一段，具有很强的形成β片层结构的倾向，目前认为该区是αsyn聚集发生的关键。但NAC区并非整个区域对聚集起重要作用，目前认为该区71～82位由12个氨基酸残基组成的片段对聚集起决定性作用;而酸性C末端区由96～140位氨基酸组成，可结合金属离子和蛋白质，影响αsyn聚集〔11〕。此外研究发现αsyn抗体识别αsyn的抗原表位位于C末端区(85～138)〔9〕。故将含有αsyn84～140位氨基酸序列基因片段的核酸疫苗pVAX1hαSyn84140质粒进行PD的治疗研究,以去除αsyn有害的毒性片段，更好发挥免疫保护作用。

　　PD中散发性约占90%，而MPTP PD小鼠模型是散发性PD最经典的模型〔12〕，且 MPTP慢性模型更符合PD的病理生理发展过程，并观察到αsyn的持续表达〔3〕。故选取MPTP慢性PD小鼠模型作为实验对象。

　　本研究显示αsyn核酸疫苗pVAX1hαSyn84140对PD有较好的治疗作用，具有广阔的开发应用前景。但如何进一步提高免疫效应以达到对黑质多巴胺细胞的完全保护及其作用的具体机制，是进一步研究的重点，并希望能通过改进疫苗的制备、使用或添加合适的佐剂，及通过多功能基因重组制备复合疫苗，以达到从不同环节联合治疗PD的目的。

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