法舒地尔对慢性脑缺血大鼠认知功能及皮层自由基代谢的影响

　　作者：王晓明 赵晴 莽靖 魏爱宣 何金婷 陈晓红 徐忠信 作者单位：吉林大学中日联谊医院神经内科，吉林 长春 130033

　　【摘要】目的 观察法舒地尔对慢性脑缺血大鼠学习记忆及皮层线粒体自由基代谢的影响。方法 大鼠分为假手术组、模型组和法舒地尔组，取3、6、9 w 3个时间点，采用双侧颈总动脉永久性阻断法(2VO)建立慢性脑缺血模型，应用Morris水迷宫检测学习记忆能力，同时检测皮层线粒体超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。结果 模型组和法舒地尔组大鼠与假手术组相比逃避潜伏期和游泳路径均明显延长，法舒地尔组学习记忆成绩均明显优于模型组(均P<0.05)，缺血3 w起，模型组大鼠皮层SOD活性显著降低，MDA含量明显升高，法舒地尔组与模型组SOD活性和MDA含量差异显著(均P<0.05)。结论 法舒地尔能明显减轻大鼠慢性脑缺血所致认知功能障碍，其机制可能通过清除自由基减轻神经功能损伤而改善学习记忆功能。

　　【关键词】 法舒地尔 慢性脑缺血 学习与记忆 自由基

　　Effect of fasudil on cognitive function of rats by mediating free radial metabolism in cortex and hippocampus

　　WANG XiaoMing, ZHAO Qing, MANG Jing, et al.

　　Department of Neurology, ChinaJapan Union Hospital of Jilin University, Changchun 130033, Jilin, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of fasudil on learning and memory function and free radical metabolism in cortex and hippocampus of the rats with chronic cerebral ischemia. Methods Chronic cerebral ischemia rats model was established by bilateral common carotid artery permanent blocking. The rats were divided into sham operation，ischemia model and fasudil groups. Learning and memory function of the rats were tested with Morris water maze, SOD activity and MDA content in cortex and hippocampus were measured. Results The escape latency and swim distance of model and fasudil groups were longer than those of sham operation group (P<0.05). SOD activity significantly decreased and MDA contents obviously increased in model group at 3 w, there were significant difference between fasudil group and model group (P<0.05). Conclusions Fasudil could improve learning and memory function of cerebral ischemia rats by scavenging free radical and mediating free radial metabolism in cortex and hippocampus.

　　【Key words】 Fasudil; Chronic cerebral ischemia; Learning and memory;Free radical

　　慢性脑缺血是血管性痴呆、Alzheimers病(AD)和Binswanger病等多种疾病发展过程中的一个共同病理过程。因此，目前非常重视对慢性脑缺血致认知功能障碍防治的研究。法舒地尔是Rho/Rock信号通路的选择性蛋白激酶抑制剂，在急性脑缺血中的作用已得到证实〔1～5〕，但在慢性脑缺血研究中其作用及机制尚未见报道。本实验在成功建立大鼠慢性脑缺血模型基础上，探讨了其对大鼠认知功能和线粒体自由基代谢变化的影响，为慢性脑缺血致认知功能障碍的治疗提供新的治疗手段和新靶点。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组

　　健康3个月龄雄性Wistar大鼠96只，体重320～340 g，由吉林大学实验动物中心提供，经Morris水迷宫实验筛选后，随机分为：假手术组、缺血模型组和法舒地尔组，每组再根据缺血时间随机分为3、6、9 w三组，每组8只。

　　1.2 模型建立及给药方法

　　慢性脑缺血动物模型，采用双侧颈总动脉永久性阻断法(2VO)进行。10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，大鼠取颈前部正中切口，钝性分离双侧颈总动脉(CCA)，套以一号手术线双重结扎，逐层缝合。手术期间严密观察呼吸变化，保证有自主呼吸。假手术组仅分离暴露双侧CCA而不结扎;法舒地尔组(盐酸法舒地尔，天津红日药业股份有限公司生产)，于术后48 h内，每天腹腔注射法舒地尔注射液7.5 mg/kg;模型组于相同时间分别腹腔注射等量氯化钠溶液。各组大鼠行2VO后3、6、9 w，再次麻醉大鼠，断头取脑，分离皮层液氮保存。

　　1.3 Morris水迷宫实验

　　以Morris水迷宫实验测定空间学习记忆能力。Morris水迷宫有圆形水池、自动摄像机及电脑分析系统组成。测试前将水注入池中，水深30 cm(即水面高出站台表面1 cm，使大鼠不能见到站台)，加入奶粉令水呈卤白色，水温控制在(26±1)℃。实验在隔音、较暗的房间内进行，各种实验条件保持不变。实验前1天将每只大鼠头部用苦味酸染色，便于摄像机及时捕捉。实验历时7 d，每天训练1次，所选入池位置分别为站台所对及相邻象限，将大鼠于象限边缘1/2弧度处头朝池壁入水，同时摄像机开始记录。记录大鼠找到站台的时间(逃避潜伏期)和游泳路径。如大鼠在120 s内未找到站台，潜伏期记为120 s。数据采集及图像分析均由图像自动监视和处理系统完成。

　　1.4 皮层超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测

　　取各组不同时间点大鼠断头取脑，分离皮层，制备10%的组织匀浆液，提取线粒体。按南京建成生物技术有限公司提供的SOD、MDA试剂盒说明书分别测定SOD活性及MDA含量，按Folin法测定蛋白浓度。

　　1.5 统计学处理

　　所有数据以x±s表示，用SSPS12.0统计软件进行组间方差分析和t检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠不同时间点学习记忆能力变化

　　缺血3、6、9 w时，与假手术组相比，模型组和法舒地尔组的大鼠学习记忆成绩均明显下降(P<0.05)，法舒地尔组各时间点学习记忆成绩均较模型组有明显提高(P<0.05)。见表1。表1 各组大鼠在不同时间点逃避潜伏期及游泳路径比较(略)

　　2.2 各组大鼠皮层不同时间点SOD活性、MDA含量变化

　　模型组大鼠3 w起，SOD活性明显下降，9 w时仍末恢复正常(P<0.05);MDA含量有所升高，3 w时与假手术组产生明显差异(P<0.05)，6 w时则恢复正常水平;法舒地尔组不同时间点SOD活性升高、MDA含量下降，与模型组比较差异显著(P<0.05)。见表2。表2 各组大鼠不同时间点SOD活性和MDA含量变化(略)

　　3 讨 论

　　有研究表明在低灌注及低代谢状态下，大鼠的学习记忆功能可发生减退〔6〕。本研究显示，慢性缺血可使大鼠逃避潜伏期和游泳路径均明显延长，大鼠学习记忆功能发生改变，并随着时间推移逐渐加重，表明已成功建立大鼠慢性脑缺血致认知功能障碍。

　　本研究在成功建立大鼠慢性脑缺血致认知功能障碍基础上，对皮层线粒体自由基水平进行了检测，同时应用法舒地尔对其进行了干预，本研究结果表明慢性低灌注可引起体内自由基清除能力下降，而自由基可进一步加重脑细胞损伤，而法舒地尔在应用3、6、9 w时，不同程度地对SOD活性及MDA含量产生了影响，Morris水迷宫学习记忆结果显示大鼠认知功能也明显改善，表明法舒地尔可通过影响自由基代谢而减轻慢性脑缺血致认知功能障碍。

　　SOD作为体内清除超氧阴离子的特异酶，其变化间接反映了体内清除自由基的能力变化，MDA是脂质过氧化反应的代谢产物，可间接反映体内自由基损伤引起的脂质过氧化反应的强弱〔7〕。研究表明，自由基代谢紊乱是低灌注时产生脑皮层及脑微血管系统损害的重要机制，氧化应激损伤在脑缺血后神经元损伤中起关键作用，当机体自由基产生过多或体内抗氧化系统受到损害，体内氧自由基就会出现失衡，蓄积过多，攻击机体，产生氧化应激〔8〕。在缺血性脑损伤中，氧化应激不但可以直接损伤细胞，导致细胞坏死，它还可以通过介导线粒体途径、DNA修复酶及转录因子等间接导致细胞凋亡〔9〕。

　　慢性脑低灌注状态下，脑组织会产生一系列的损伤级联反应，包括钙稳态失衡、兴奋性氨基酸的毒性作用、氧化应激损伤、线粒体功能障碍等，以及随之产生的蛋白酶激活、基因表达的改变，最终导致神经元的损伤和死亡〔10〕。由于神经元在功能和数量上的改变，导致其生理功能的改变，使其学习记忆功能受到损害，这可能是慢性脑低灌注状态下大鼠学习记忆能力下降的主要原因。

　　法舒地尔是具有异喹啉(isoquinoline)结构的磺胺类衍生物，是Rho激酶抑制剂，能够扩张动脉血管，拮抗细胞内钙离子抑制肌动-肌球蛋白的相互作用。Rho激酶广泛表达于神经元、血管内皮细胞及炎性细胞，参与脑缺血后神经细胞损伤及血管内皮细胞通透性变化，Rho激酶活性改变可直接影响微循环血管结构及收缩性，参与炎性神经元损伤，而这些病理生理过程是缺血性脑损伤引发认知功能障碍的共同通路。已有研究表明，Rho激酶可增强血管内皮细胞的通透性，参与内皮细胞的收缩，并参与氧化型低密度脂蛋白，凝血酶，溶血磷脂酸诱导的内皮细胞屏障功能的改变，也可通过向下调节内皮细胞一氧化氮合酶(NOS)的表达来参与缺血后神经元损伤的发生与发展，Rho激酶抑制剂可改善急性脑缺血后脑灌注，减小梗死体积，Rho激酶抑制剂可明显抑制内皮细胞的通透性 〔1～5〕。提示法舒地尔可能通过抑制Rho激酶，从而改善由2VO所致的慢性脑低灌注以及由此引起的一系列反应，如氧化应急损伤等从而减轻了神经元损伤的程度，改善了大鼠的学习、记忆功能。

　　脑缺血后自由基代谢紊乱与认知能力障碍的相互关系以及相关的一些治疗目前尚无深入研究，通过本实验结果，希望能为进一步研究提供一些生理和病理学依据，为脑缺血后认知功能障碍的有效治疗提供帮助。而法舒地尔是Rho/Rock信号通路的选择性蛋白激酶抑制剂也可能成为慢性脑缺血致认知功能障碍的治疗的新靶点。

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　　9 Cui J，Holmes EH，Greene TG，et al.Oxidative DNA damage precedes DNA fragmentation after experimental stroke in rat brain〔J〕.FASEB J，2000;14(7)：95567.

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