大豆异黄酮对Aβ25～35诱导的Alzheimer病模型大鼠海马组织形态及超微结构的影响

　　作者：王萍 毕建忠 王世军 于君 谢兆宏 王晓云 作者单位：山东大学第二医院神经内科，山东 济南 250033　1 山东中医药大学 2 山东中医药大学附属医院

　　【摘要】目的 研究大豆异黄酮对Aβ25～35诱导的Alzheimer病(AD)模型大鼠海马组织形态及超微结构的影响。方法 采用Aβ25～35双侧海马注射的AD模型大鼠，分组后给予不同剂量大豆异黄酮，HE染色及透射电镜观察大豆异黄酮对海马组织形态及超微结构的影响。结果 HE染色显示，模型组大鼠海马CA1～CA4区及齿状回神经元数量较假手术组明显减少，可见较多的神经细胞胞质浓染，核固缩。大豆异黄酮治疗组及雌激素治疗组神经元数量较模型组增多，胞质浓染神经元少见。透射电镜下，模型组海马CA1区神经元较少，可见部分神经细胞膜皱缩，胞体缩小，核膜完整，核染色质电子密度增强。大豆异黄酮治疗组大鼠海马CA1区异常神经元较模型组明显减少。 结论 大豆异黄酮能有效地改善Aβ25～35所致AD大鼠海马神经元丢失。

　　【关键词】 Alzheimer病 大豆异黄酮 超微结构

　　大豆异黄酮是富含于大豆及其制品中的植物雌激素，可与雌激素受体(ER)结合，表现弱雌激素作用。研究〔1〕发现大豆异黄酮能提高和改善正常人和动物的认知功能，但是其机制目前尚不十分清楚。体外细胞培养发现大豆异黄酮可保护皮质神经元免受β淀粉样蛋白(Aβ)的毒性作用〔2〕。在体内环境中，大豆异黄酮是否能拮抗Aβ的毒性，起到神经保护作用，本实验对此进行了进一步研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及分组

　　健康雌性Wistar大鼠(山东大学实验动物中心提供)，鼠龄10～12月，体重350～450 g，共60只。常规环境饲养。完全随机分5组，每组12只，分别为Aβ+蒸馏水组(模型组)、Aβ+低剂量大豆异黄酮(26.3 mg·kg-1·d-1)组(低剂量组)、Aβ+高剂量大豆异黄酮(52.6 mg·kg-1·d-1)组(高剂量组)、Aβ+雌激素组(雌激素组)及假手术组。

　　1.2 Aβ25～35的孵育

　　用无菌生理盐水将Aβ25～35(Sigma公司产品)稀释成5 μg/μl，37℃孵育72 h，使其变为聚集状态的Aβ25～35，放在4℃冰箱备用。

　　1.3 动物模型的建立

　　予大鼠10%水合氯醛380 mg/kg腹腔注射。麻醉成功后，将大鼠固定于脑立体定向仪上。头顶部正中切口暴露前囟。参照大鼠脑立体定位图谱〔3〕，以前囟为原点，向后3.5 mm，旁开2.0 mm，为穿刺点,钻孔穿颅，自脑表面进针3.0 mm至双侧海马，用微量注射器将Aβ25～35各1 μl缓慢注入(5 min)，留针5 min，以使Aβ25～35充分浸润局部组织。退出针后，缝合伤口，常规饲养。假手术组，注射等体积的生理盐水。

　　1.4 给药

　　模型建立后第2天，低剂量组和高剂量组分别予2.63 mg/ml、5.26 mg/ml的95%大豆异黄酮溶液3.8 ml灌胃，每天1次;模型组予等体积的蒸馏水灌胃;雌激素治疗组予苯甲酸雌二醇(1 mg·kg-1·d-1)肌注。持续18 d。

　　1.6 病理形态学检查

　　1.6.1 HE染色

　　用药18 d后，将各组大鼠于4%多聚甲醛心脏灌注固定，断头取脑。将脑组织置于4%多聚甲醛中固定24 h。常规石蜡包埋。制成4 μm厚连续切片，行苏木素伊红(HE)染色，光学显微镜观察海马组织形态学变化并拍照。

　　1.6.2 超微结构观察

　　各组随机选取一只大鼠，10%水合氯醛麻醉后，快速取脑，并将取出的脑组织置于冰上，自海马CA1区切取2 mm×2 mm×1 mm脑组织块，2.5%戊二醛固定24 h，1%四氧化锇酸再固定3 h，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子染色，每个标本选取连续4张切片，置于透射电镜下观察海马超微结构的变化并拍照。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠海马组织病理学观察

　　HE染色显示假手术组大鼠海马CA1～CA4区神经细胞呈锥形，有长的突起，核浆比值大，细胞核为圆形或椭圆形，着色均匀为浅蓝紫色，可见深染的核仁。在CA1区锥体细胞排列为3～4层。模型组大鼠海马CA1～CA4区及齿状回神经元数量较假手术组明显减少，可见较多的神经细胞胞体缩小，胞浆浓缩，核固缩，整个细胞深染成红色，以CA1区、CA3区和齿状回为著，CA1区细胞排列为1～3层。低剂量组神经元数量较模型组增多，胞质浓染的神经元数量较模型组减少。高剂量组、雌激素组变化相似，神经细胞排列较紧密，着色均匀，胞质浓染神经元少见。

　　2.2 大鼠海马组织超微结构观察

　　透射电镜下，假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞多呈锥体形、多边形，细胞质内含各种细胞器及包涵物。线粒体体积较小，嵴排列整齐。粗面内质网和游离的核蛋白体聚集成片成堆，分散在胞质内，构成尼氏体。胞浆内散在数个脂褐素颗粒。细胞核呈圆形或椭圆形，细胞核浆比值大，核膜有两层膜组成，并有等距离得核孔，核内染色质呈细粒和分散状，分布均匀，染色较浅，核内常有一深染的核仁(图1)。神经突触较多，突触内线粒体形态正常，突触小泡较多(图2)。模型组海马CA1区锥体细胞明显减少，可见一些神经细胞膜皱缩，胞体缩小，胞浆浓缩，其内细胞器集中，神经细胞可见线粒体轻度肿胀，粗面内质网扩张，核糖体、脂褐素颗粒增多、集中，核染色质电子密度增强，核仁扩大，变形。神经元处于凋亡的早期(图3)。神经胶质相对增生，吞噬功能增强，细胞内可见较大的吞噬体(图4)。部分神经胶质胞浆浓缩，核周池扩大，核内染色质浓缩呈块状，电子致密度增加，具有凋亡细胞的特征(图5)。神经突触减少，部分突触内线粒体出现空泡化，突触小泡减少(图6)。 低剂量大豆异黄酮治疗组大鼠海马CA1区神经元较模型组明显增加，部分神经元形态与模型组相似，但异常神经元数量显著减少，突触数量明显增加，异常突触较少。高剂量大豆异黄酮治疗组及雌激素治疗组大鼠海马CA1区神经元较模型组及低剂量治疗组明显增加，凋亡神经元明显减少，异常突触少见。各组均可见个别神经元出现尼氏体溶解，脱颗粒现象(图7)。

　　3 讨 论

　　AD的病因及发病机制目前尚不十分清楚。越来越多的证据表明，Aβ是各种原因诱发AD的共同通路，是AD形成和发展的关键因素。它可以通过诱导神经元凋亡、诱发炎症级联反应、触发氧化应激、干扰神经元离子体内平衡发挥毒性作用，引起广泛的神经元/神经轴索功能障碍，神经细胞死亡，导致痴呆形成。

　　本研究采用双侧海马内一次性注射 Aβ25～35诱导大鼠AD模型，HE染色显示模型组大鼠海马CA1～CA4区及齿状回神经元数量较假手术组明显减少，可见较多的神经细胞胞体缩小，胞浆浓缩，核固缩，整个细胞深染成红色，以CA1区、CA3区和齿状回为著，CA1区细胞排列为1～3层。其病理学改变与叶静等观察到的相似〔4〕。从病理改变上来评价，该模型是成功的。进一步透射电镜下，观察到模型组海马CA1区锥体细胞明显减少，可见一些神经细胞膜皱缩，胞体缩小，胞浆浓缩，其内细胞器集中，核染色质电子密度增强，核仁扩大。神经元处于凋亡的早期。神经胶质相对增生，吞噬功能增强，部分细胞具有凋亡细胞的特征。神经突触及突触小泡减少。这些改变表明，Aβ25～35注射后海马神经元减少以细胞凋亡的形式为主。与临床上观察到AD病人脑内海马区细胞凋亡明显增加相一致。各组所见个别神经元出现尼氏体溶解，脱颗粒现象，考虑与注射针头的机械性损伤有关。

　　大豆异黄酮为杂环多酚类化合物，为非甾体类激素。其主要成分是三羟异黄酮(genistein)、二羟异黄酮(daidzein)和6甲氧基大豆素(glycitein)。它们的结构与17β雌二醇相似，带有两个或三个芳香环，每个环上都有一个羟基取代，可与雌激素受体(ER)结合，表现弱雌激素作用。体外细胞培养中，Wang发现genistein可通过抑制caspase酶级联反应和活性氧族(ROS)产生，从而保护皮质神经元免受Aβ的毒性作用〔5〕。我们研究发现，Aβ25～35诱导的AD大鼠模型予大豆异黄酮喂养后，利用Morris水迷宫测试认知功能，其学习记忆功能较模型组明显增强〔6〕。免疫组化检测，大豆异黄酮治疗组大鼠海马caspase3表达较模型组明显减少〔7〕。表明大豆异黄酮可通过抗神经元凋亡改善动物认知功能。本研究发现，大豆异黄酮喂养后，大鼠海马CA1区神经细胞排列较紧密，着色均匀，胞质浓染神经元少见;电镜下神经元较Aβ组明显增加，异常神经元数量显著减少，突触数量明显增加，异常突触较少，且高剂量治疗组较低剂量治疗组效果明显，高剂量治疗与雌激素治疗相似。表明大豆异黄酮能明显减少Aβ25～35所致的海马神经元丢失，在体内具有神经保护作用，且具有剂量依赖性。

　　大豆异黄酮与雌激素相似，可通过血脑屏障进入大脑亲脂性环境。其保护作用是通过ER，从两方面发挥作用：①长期基因组作用：通过与核内受体及DNA的特殊位点结合而开启或关闭基因;②快速的非基因组作用：植物雌激素与细胞膜上的受体结合，通过第二信使，完成信号转导，控制基因表达〔7〕。目前发现ER有两种亚型ERα和ERβ。在大脑中两种受体共同表达，但以ERβ表达明显，大脑额叶及小脑尤著。ERβ具有重要的生理作用，在ERβ基因敲除鼠，可观察到部分脑区神经元细胞数减少，星形胶质细胞增多〔8〕。动物实验及体外细胞培养证实，植物雌激素对ERβ的亲和力高于ERα，尤其是三羟异黄酮对ERβ的亲和力与17β雌二醇相同〔9〕。

　　神经元减少是AD重要的病理特征，与患者智能衰退的程度关系密切。本研究通过采用Aβ25～35双侧海马注射诱导的AD模型并予大豆异黄酮干预，观察到在体内环境中大豆异黄酮能明显减少Aβ25～35所致的海马神经元及突触的丢失，具有神经保护作用。表明大豆异黄酮对AD大鼠的治疗作用与雌激素相似，是治疗AD的可供选择的手段，从而大豆异黄酮治疗AD提供了实验依据，为其广泛应用提供了理论依据。

　　【参考文献】

　　1 Lephart ED，West TW，Weber KS,et al.Neurobehavioral effects of dietary soy phytoestrogens〔J〕.Neurotoyicol Teratol，2002;24:5.

　　2 Andersen JM,Myhre O,Fonoum F.Discussion of the role of the extracellular signalregulated kinase oxygen species in Alzheimer′s disease〔J〕. Neurochem Res,2003;28:31926.

　　3 包新民,舒斯云.大鼠脑立体定位图谱〔M〕.北京:人民卫生出版社,1991:445.

　　4 叶 静,刘协和,邓 红,等.β淀粉样多肽诱导神经元凋亡和氧化应激机制的实验观察〔J〕.中国临床神经科学,2002;4:3324.

　　5 Wang CN,Chi CW.The neuroprotective effects of phytoestrogen on amyloid proteininduced toxicity are mediated by abrogating the activation of caspase cascade in rat cortical neurons〔J〕.Biochemistry,2001;276:528795.

　　6 毕建忠，王 萍，王世军，等.大豆异黄酮对AD大鼠认知功能及海马NR2B表达的影响〔J〕.临床神经病学杂志，2005;18(6)：4325.

　　7 毕建忠，王 萍，于 君，等.大豆异黄酮对AD大鼠模型海马caspase3表达的抑制作用〔J〕.中国老年学杂志,2005;25 (9)：10846.

　　8 Scott M,Belcher,Zsarnorszky A.Estrogenic actions in the brain：estrogen，phytoestrogens，and rapid intracellular signaling mechanisms〔J〕.J Pharmacol Exp Ther,2001;299:40814.

　　9 Wang L,Andersson L,Warnet M,et al.Morphological abnormalities in the brain of estrogen receptorβ knockout mice〔J〕.PNAS,2001;98:27926.

　　10 Nikov GN,Hopins NE,Boue S,et al.Interactions of dietary estrogens with human estrigen receptors and the effect on estrogen receptorestrogen response element complex formation〔J〕.Environ Health Perspect,2000;108:86772.