银杏叶提取物对6-OHDA诱导PC12细胞Bax和Bcl-2表达的影响

　　作者：王杰，程言博，印晓星 作者单位：江苏省脑病生物信息重点实验室开放课题(Jsbl0702) 徐州医学院药学院，江苏徐州221002;徐州医学院附属医院神经内科，江苏 徐州221002

　　【摘要】 目的 探讨银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract,GBE)对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及其机制。方法 经不同浓度GBE预处理体外培养的PC12细胞加入6-OHDA诱导多巴胺能神经元损伤模型，用4-甲基偶氮唑蓝(MTT)检测 PC12 细胞活力;流式细胞仪(FCM)测定PC12细胞凋亡百分比;采用免疫印迹法检测Bcl-2和Bax的表达水平。结果 100 μmol/L的6-OHDA处理PC12细胞24 h，细胞活力较正常对照组明显降低(P<0.01);与模型组比较，GBE 20，40 μg/ml可明显减轻6-OHDA对PC12细胞的毒性，GBE可使细胞活性增强，降低凋亡百分比。与正常对照组比较，模型组Bax表达升高，而Bcl-2表达降低(P<0.05)。与模型组比较，GBE各剂量组Bax降低，而Bcl-2升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)。结论 GBE对6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡具有抑制作用，上调Bcl-2和下调Bax表达可能是其作用的机制之一。

　　【关键词】 银杏叶提取物;PC12细胞;6-羟基多巴胺;细胞凋亡

　　The protective effect of Ginkgo biloba extract on the expression of Bax and Bcl-2 in 6-hydroxydopamine-induced PC12 cells

　　WANG Jie, CHENG Yanbo, YIN Xiaoxing*

　　(School of Pharmacy, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China; Department of Neurology, The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002)

　　Abstract: Objective To investigate the protective effect and the causal mechanism of Ginkgo biloba extract (GBE) against PC12 cellular apoptosis induced by 6-hydroxydopamine (6-OHDA). Methods Dopaminergic neuronal injury model was induced by addition of 6-OHDA into PC12 cells cultured in vitro and pretreated at different concentrations of GBE. Cell viability, apoptotic percentage, and the expression of Bax and Bcl-2 were assayed by MTT, FCM and immunoblotting, respectively. Results The livability of PC12 cells treated with 100 μmol/L 6-OHDA for 24 h was lower than that of the control group (P<0.01). Compared with the 6-OHDA group, GBE at concentrations of 20 and 40 μg/ml could markedly relieve the toxicity of 6-OHDA on PC12 cells, which suggested that GBE could increase the cellular activity and decrease the percentage of cellular apoptosis. The Bax expression was up-regulated in 6-OHDA groups and Bcl-2 expression was down-regulated (P<0.05), compared with the control group. Compared with the 6-OHDA group, the Bax expression was down-regulated and Bcl-2 expression was up-regulated in GBE groups, in a dose-dependent manner (P<0.05). The difference had statistic significance. Conclusions As one of the causal mechanisms, GBE has inhibitory effects on the apoptosis of the 6-OHDA-induced PC12 cells by up-regulating Bcl-2 expression and down-regulating Bax expression.

　　Key words: Ginkgo biloba extract; PC12 cells; 6-hydroxydopamine; apoptosis

　　帕金森病 (Parkinson disease, PD) 是一种以黑质纹状体通路的退变为主要特征的神经系统变性疾病。近年来许多基础和临床研究表明，氧化应激反应增强在PD黑质神经元凋亡中起着主要作用，氧自由基清除系统的缺陷在PD发病机制中具有重要的病因学意义，故采用抗氧化治疗正日益成为治疗PD的重要手段[1-2]。氧化应激损伤涉及到氧化应激和抗氧化系统的失衡，因此，可以通过摄入抗氧化剂限制氧化损伤[3]。银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract, GBE)主要含黄酮甙类、萜类和酚类等，具有清除自由基和过氧化脂质、对抗兴奋性神经递质的释放、拮抗血小板活化因子等多种药理活性[4]，临床已广泛用于心脑血管疾病及老年痴呆症的治疗。但GBE对氧化应激损伤神经元是否有保护作用，报道甚少。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株(PC12细胞)由于其本身的特性常被用作神经元模型。因此，本研究以6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)损伤PC12细胞为氧化应激损伤神经元的模型，探讨GBE对氧化应激损伤神经元的保护作用及其防治PD的可能性。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂 GBE为德国威玛舒培博士药厂产品(17.5 mg/5 ml)，6-OHDA为Sigma公司产品，Annexin V-FITC凋亡测定试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司，胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、4-甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Amresco公司，DMEM 培养基为美国GIBCO公司产品，新生牛血清、马血清购自杭州四季青生物工程公司，鼠源Bcl-2单抗(C-2)(No. sc-7382)和Bax 单抗(B-9)(No.sc-7480)购自北京中杉生物技术有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京碧云天生物技术研究所。

　　1.2 细胞培养 PC12细胞购于中科院上海细胞所。培养于含体积分数为5%马血清、10%新生牛血清，1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素及2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM培养液中，用NaHCO3和HCl调pH值至7.0～7.2(完全培养液)。于37℃、5%CO2条件下培养，每2～3天换液1次。细胞80%融合时，用0.125%胰蛋白酶消化，1∶3分瓶传代。选取对数生长期细胞进行实验处理。

　　1.3 药物处理 细胞接种24 h 后给予处理因素。①对照组(NS)：PC12细胞正常培养于DMEM完全培养液中;②模型组(6-OH)：完全培养液中加入终浓度为100 μmol/L的6-OHDA(预实验以6-OHDA 25、50、100、150、200 μmol/L孵育PC12 细胞6、12、24 h和48 h后以MTT测定细胞存活率，结果选定6-OHDA 100 μmol/L作用24 h作为实验的干预点，其细胞生存率为51.6%);③GBE低中高剂量组(GL、GM、GH)：GBE(终浓度分别为10、20、40 mg/L，通过预实验确定)作用2 h后，加入终浓度为100 μmol/L 6-OHDA的完全培养液。从6-OHDA加入起继续培养24 h，供检测。

　　1.4 MTT法检测PC12细胞存活率 细胞以2×107个/L接种于96孔板，培养24 h后进行药物处理，按1.3要求分5组。每组设6孔，同时设3孔无细胞空白对照。加药后继续培养24 h，终止培养前4 h每孔加入MTT液20 μl，置37℃继续培养4 h。弃上清，每孔加入DMSO 150 μl，振荡10 min，终止反应并充分溶解甲臜颗粒，用全自动酶标光度仪进行比色,波长为570 nm，记录各组的D值(D测=D实-D空均)，结果以均数±标准差表示。各实验组PC12细胞活力以各实验组的D值与正常对照组的D值的比值表示。实验重复3次。

　　1.5 细胞凋亡检测 PC12细胞经分组加药处理后，5%CO2、37℃培养24 h，把细胞培养液分别吸出， PBS洗涤贴壁细胞1次，胰酶消化。消化下来的细胞加入转移的原培养液，混匀，1000 r/min心5 min，弃上清， PBS重悬并计数。分别取5～10万个重悬细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入195 μl Annexin V-FITC结合液(1×)重悬，加入5 μl Annexin V-FIT，混匀。避光孵育10 min。1000 r/min离心5 min，弃上清，加入190 μl Annexin V-FITC结合液(1×)重悬，加入10 μl碘化丙啶染色液，混匀。FAC SVantage SE型流式细胞仪(Becton Dickinson，USA)检测细胞凋亡的情况。

　　1.6 免疫印迹检测Bcl-2、Bax的表达 将80%左右融合、状态良好的细胞进行消化，制成细胞悬液(2×108/L)，各取2 ml 加入5个培养瓶，加完全培养液至10 ml，5%CO2、37℃培养至70%左右融合，换含1%新生牛血清的培养液细胞同步化12 h后，按分组要求加药继续培养24 h。以预温至37℃的PBS 2 ml 洗涤2次，吸干多余PBS。置冰袋上，各加入细胞裂解液300 μl，铺满细胞生长面，裂解20 min，收集细胞于1.5 ml EP管，4000 r/ min离心10 min，移上清于新EP管，得细胞处理液。按BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质量含量。将所有蛋白样品调至等浓度，加1×loading buffer溶解后直接上样，剩余溶液低温储存(-70℃ 1个月，-20℃ 1周，4℃ 1～2天)，每次上样前98℃，5 min。按80 μg/孔上样，经12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以半干转法转移至NC膜。经3%BSA封闭3 h，加入按1∶300体积比稀释的Bcl-2、Bax鼠源单克隆抗体，4℃过夜。用洗涤液洗膜，加入相应1∶1000体积比稀释的二抗(兔抗鼠)，37℃反应2 h。洗膜3次，以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。β-actin以相同方法检测。结果以Quantity One图像处理仪(Bio-Rad公司, USA)处理，进行光密度(D)分析，蛋白表达的变化以实验组中相应条带的D值相对于β-actin的倍数表示。

　　1.7 统计学处理 计量资料用±s表示，用SPSS 13.0统计软件进行分析。多组间差异的显著性分析用单因素方差分析，组间两两比较方差齐用SNK检验。检验水准：α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 PC12细胞活力的变化 与正常对照组(NS)相比，模型组(6-OH)PC12细胞的活力显著下降(P<0.01)，提示6-OHDA对细胞有损伤作用。GBE低中高浓度给药后，相对于模型组，PC12细胞的活力逐渐提高(P<0.05)，这种改变呈剂量依赖性，提示GBE在一定范围内对PC12细胞损伤具有保护作用 (表1, 图1)。

　　表1 GBE对细胞活力和细胞凋亡率的影响(略)

　　NS:正常对照组;6-OH:模型组;GL，GM，GH：GBE低、中、高剂量组。与正常对照组比较：cP<0.05;与模型组比较： fP<0.05

　　图1 流式细胞仪检测PC12细胞凋亡(略)

　　各图左上角为凋亡细胞，左下角为正常细胞，右上角为坏死细胞

　　2.2 PC12细胞凋亡百分比的变化 与正常对照组相比，模型组PC12细胞的凋亡百分比显著增高(P<0.01)，提示6-OHDA能诱发PC12细胞凋亡。相对于模型组，GBE各剂量组的细胞凋亡百分比均有显著降低(P<0.05)。表明GBE可以明显降低6-OHDA诱发的PC12细胞凋亡(见表1,图1)。

　　2.3 GBE对Bcl-2和Bax表达的影响 Bcl-2是重要的抗凋亡基因，而Bax则是重要的促凋亡基因。模型组Bcl-2的表达显著降低，而Bax的表达则显著增加，Bax/ Bcl-2的比值显著提高，与正常对照组相比有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，GBE各剂量组Bcl-2的表达逐渐增加，Bax的表达则逐渐减少，Bax/Bcl-2的比值也逐渐降低且呈剂量依赖性(P<0.05)(图2)。

　　图2 免疫印迹法测定GBE对Bax和Bcl-2表达的影响(略)

　　A：免疫印迹法结果，β-actin为内参;B：比色结果。与正常组比较：cP<0.01;与模型组比较：fP<0.05

　　3 讨论

　　PD的主要病理变化是中脑黑质和黑质纹状体通路DA神经元的变化和缺失。目前，人们对PD发病机制仍未明确，但越来越多的研究表明选择性DA神经元损伤和丧失与神经元凋亡密切相关[5-6]，出现PD症状的患者其脑内DA能细胞80%以上发生凋亡[7]。Tang等[8]研究认为各种病因可经由细胞凋亡这一条共同路径而导致PD发病，凋亡是导致PD神经元变性的基础。PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，它能表达酪氨酸羟化酶并且合成多巴胺，因而也被称为DA能细胞。6-OHDA是一种神经毒素，由于结构与DA类似，可被摄入到DA能神经元内，通过形成羟自由基和抑制线粒体氧化呼吸链复合物Ⅰ和Ⅳ，干扰ATP合成，选择性引起DA能神经元死亡[9]。所以，本实验采用6-OHDA诱导PC12细胞Bax和Bcl-2表达，从细胞水平探讨GBE对PD的治疗作用及可能的机制。结果显示，6-OHDA能够诱导PC12细胞凋亡，使细胞存活率降低，成功建立了6-OHDA诱导的细胞损伤的PD模型，并通过GBE的干预，采用免疫印迹法检测了Bcl-2和Bax表达的变化。与正常对照组比较，6-OHDA处理组Bcl-2表达降低，Bax表达升高，而银杏叶提取物对Bcl-2表达降低和Bax表达升高具有抑制作用。

　　正常情况下，多巴胺能神经元的凋亡受细胞内基因(抑制细胞凋亡基因、促细胞凋亡基因和在细胞凋亡过程中起协助作用的基因)和细胞外因素的共同调节。促凋亡和抗凋亡的Bcl-2类蛋白的比例能够调节线粒体死亡信号通路，在氧化应激环境下有利于凋亡的发生。其中Bcl-2是重要的抗凋亡基因，Bax则是重要的促凋亡基因，与Bcl-2基因有21%的同源性。Bax/Bcl-2的增高改变了线粒体的完整性，引起凋亡特定蛋白(如cyt C，凋亡诱发因子等)的释放，进而导致caspase-9的活化，最终活化caspase-3导致细胞凋亡。GBE是具有多种药理活性的中药制剂，目前临床已广泛用于老年痴呆的治疗。有实验[10]显示GBE能防止黑质细胞损伤，对大鼠PD的发病有一定的预防和治疗作用，为临床用于PD防治提供了实验依据。另一实验研究证明, GBE 可以降低左旋多巴的神经毒性，和左旋多巴合用治疗PD是个可行的方法，而且效果比单独使用左旋多巴更好[11]。本实验采用不同剂量的GBE作用于PC12细胞，免疫印迹方法观察JNK介导的非核通路中的Bcl-2与Bax的变化，发现GBE可以增加PC12细胞Bcl-2的表达并抑制Bax的表达，且具有一定的剂量依赖性。初步提示GBE可能对PD有一定的治疗作用，其机制可能与阻断神经元的非核通路有关。

　　然而，GBE是药理作用非常宽泛的中药制剂，其对于神经元凋亡的预防是主要通过抗氧化作用，还是另有其他途径?GBE的抗凋亡作用是否只是其神经保护作用的一个方面?还有待于进一步深入研究。

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