代谢型谷氨酸受体5在大鼠急性脑缺血中的变化

　　作者：张茂林 刘俊平 杨巧莲 周立社 吴跃华 作者单位：(包头医学院第一附属医院神经内科，内蒙古包头 014010;包头医学院生物化学与分子生物学教研室)

　　【摘要】 目的：观察大鼠大脑皮质中代谢型谷氨酸受体5(metabotropic glutamate receptor 5,mGluR5)在脑缺血不同时段的表达及其动态变化的规律，探讨其在急性脑缺血中变化的意义。方法：35只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、脑缺血1h组、3h组、6h组、12h组、24h组(均为手术组)及其相对应的假手术对照组，采用大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，至上述规定时间点取大脑组织，行HE染色，用光学显微镜观察神经元损伤程度;用免疫组织化学技术判断神经元阳性表达的强弱;用形态分析系统检测各组mGluR5表达的灰度值。结果：各手术组mGluR5表达均高于假手术对照组及正常对照组，与正常对照组相比，缺血1h其表达即有升高，至12h达高峰。而假手术对照组与正常对照组相比无统计学意义。结论：急性脑缺血可引起mGluR5表达上调，提示mGluR5参与了局灶性脑缺血损伤，可能促进了缺血性脑血管病的发展。但结合以前的研究，我们推测其上调也可能是一种为清除谷氨酸(Glu)而作出的反应性增高，是一种维持机体平衡的自我保护机制。

　　【关键词】 脑缺血;代谢型谷氨酸受体5

　　*基金项目：内蒙古自然科学基金资助项目(200208020618)

　　The Changes of Expression of mGluR5 Induced by Acute Cerebral Ischemia in Rats

　　ZHANG Maolin, LIU Junping, YANG Qiaolian, et al

　　(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baotou Medical Colege, Baotou 014010，China)

　　Abstract Objecive: To observe the expression of mGluR5 and the dynamic regulation in the cortex of rats with focal cerebral ischemia in different phases and to investigate its significance in acute ischemia .Methods:Thirty-five male Wistar rats were randomly divided into 11 groups: The normal contral, sham operation and ischemic operation (subdivided into 1,3,6,12 and 24- hour) by middle cerebral artery occlusion model.Brain specimens of the rats from each group were obtained for HE staining and immunohistochemistry staining.To observe the damage of neurons with light microscope and to judge the positive expression of neurons, and then to detect the changes of gray scale value in each group.Results:Compared with the normal and each sham control group,the expression of mGluR5 in each ischemia operation group was elevated 1h after ischemia and reached the peak within 12 hours after ischemia. However,there was was no significant difference between normal and sham control groups.Conclusion:Acute cerebral ischemia can cause up-regulated expression of mGluRs, suggesting that up-regulated expression of mGluR5 might be related with focal cerebral ischemia and it contributed to the development of cerebrovascular disease.According to the results of previous study,however,we presume the up-regulated expression might be the responsive increase in order to remove glutamate, which is a protect mechanism for maintain balance of organism.

　　Key words Cerebral ischemia; Metabotropic glutamate receptor 5; Rat Immunohisitochemistry

　　目前关于谷氨酸受体的研究很多，但多集中在离子型谷氨酸受体NMDA及其拮抗剂上。随着研究的深入，代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors,mGluRs)在神经疾病中的作用日益受到重视。mGluR5参与了中枢神经系统(CNS)的许多病理生理过程，但目前的研究并不深入。为了研究mGluR5在脑缺血中的作用机制，我们在MCAO模型基础上，动态研究mGluR5在缺血性脑血管病中表达的变化，以待从分子水平揭示mGluR5在脑缺血中的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及材料 健康Wistar雄性大白鼠35只，体重240～280g，由内蒙古大学动物试验中心提供。兔抗鼠mGluR5多克隆抗体购自美国Chemcon公司;即用型第二代免疫组化ElivisionTMplus广谱试剂盒、DAB显色试剂盒、APES、中性树胶为迈新生物技术(福州)产品。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 动物分组 将动物随机分为正常对照组(NC)、脑缺血后1h组、3h组、6h组、12h组、24h组(手术组，IG)及假手术对照组(SOC),每组5只。

　　1.2.2 动物模型制备 大鼠大脑中动脉缺血模型采用Koixumi和Longa等方法[1]，大鼠用3%戊巴比妥钠(0.1～0.15mL/100g)腹腔注射麻醉。麻醉大鼠仰卧固定于手术台上，颈部正中切口，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)。电凝ECA分支，结扎游离ECA主干。分离ICA主干至翼腭动脉(PPA)，结扎PPA。ECA残端剪一小口将拴线插入，轻推尼纶线尾端经CCA分叉部沿ICA入颅，进线深度由分叉部计算约18.5±0.5mm。这样便制成了大脑中动脉闭塞模型。假手术组除不插尼纶线外，其余步骤同缺血组。

　　1.2.3 组织切片制备 分别在所须时间点，给予大鼠3%戊巴比妥钠0.5mL腹腔注射麻醉后断头取脑，自额极至枕叶分A、B、C、D、E5等份取C 脑片置于4℃ 4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定24h，常规脱水，浸蜡，包埋，制成5μm厚冠状切片。

　　1.2.4 光镜观察 取各组大鼠组织切片，经HE染色后，用光学显微镜观察神经元损伤程度;用免疫组织化学技术判断神经元阳性表达的强弱;用形态分析系统检测各组mGluR5表达的灰度值。

　　1.2.5 免疫组化法检测 mGluR5采用辣根氧化酶链霉卵白素染色(SP法)。

　　1.3 图像分析 采用江苏省捷达科技公司的形态分析系统进行图像分析，每张切片随机选取10个单位面积，测量免疫组化染色的灰度值。

　　1.4 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件，各组数据均以均数±标准差(x±s)表示，两组间数据比较采用t检验，并进行方差齐性检验。P<0.05视为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 神经细胞病理形态学改变 光镜观察正常对照组、假手术对照组神经细胞形态结构正常、核圆淡染、核仁明显，未见组织坏死(图1);而手术组缺血灶内可见血管和神经元周围胶质成分肿胀，神经元呈三角形或杆状，胞核偏位并深染，有的甚至裂解、消失(图2);脑缺血时间越长，细胞变化越明显，缺血重的组织内甚至可见液化性坏死灶，灶内神经元残存较少甚至缺失。

　　2.2 免疫组化结果 免疫组化阳性细胞信号呈棕黄色，在正常组织内mGluR5主要位于细胞膜和胞浆内(图3)，缺血后大脑皮层mGluR5阳性神经元显著增加，有些神经元胞浆内着色亦增强(图4)。与相应时间点HE染色结果比较，发现mGluR5强阳性神经细胞以缺血灶及其周围部位最为显著，但一些缺血较重的组织内看不到阳性神经元或仅有少量染色。另外，可见缺血灶内胶质成分呈颗粒状，背景染色较正常组浅。

　　图1 假手术对照组大鼠脑皮质(HE，×200)(略)

　　图2 脑缺血后24h大鼠脑皮质(HE，×200)(略)

　　图3假手术对照组大鼠脑皮质mGluR5表达(×200)(略)

　　图4脑缺血后24h大鼠脑皮质mGluR5表达(×200)(略)

　　与正常对照组相比，各假手术对照组神经元信号灰度均无明显改变(P﹥0.05);与假手术对照组相比，手术组神经元信号灰度值于脑缺血后1h即有逐渐降低，12h为最低，故mGluR5表达于脑缺血后1h即有明显增加﹙P﹥0.05﹚，12h表达达高峰。详见表1。

　　表1 各组mGluR5灰度值的变化(略)

　　*与NC和相对应的SOC组比较，P<0.05

　　3 讨论

　　mGluR5参与了CNS的许多病理生理过程,但目前的研究并不深入。据报道，mGluR5与脑缺血、外伤、癫痫、帕金森病、疼痛及精神疾病等许多疾病相关[2-5]。

　　目前关于mGluR5在缺血性脑血管病中的作用尚无定论。有资料报道mGluR5 mRNA在缺血性脑损伤中表达下调[2]，认为其发挥了保护作用;另一些则报道mGluR5 mRNA表达上调，有加重神经元损害的作用[6]。但关于其在缺血性脑血管病中的具体机理，目前并未阐明。多认为活化的mGluR5导致磷酸肌醇(phosphoino- sitide,PI)水解增加，引起二酯酰甘油和IP3的形成和胞内储存Ca2+的活化[7]。

　　目前克隆大鼠的mGluR5 cDNA总长度为3 918bp(Genbank),编码1 171个氨基酸残基，组成7次跨膜蛋白。mGluR5有三部分组成：第一部分为N-末端细胞外功能域，第二部分为在胞膜处形成7个跨膜域，第三部分是细胞内功能域[8]。

　　我们在大鼠MCAO模型的基础上，揭示了脑缺血自然病程中mGluR5的变化过程。伤后不同时间脑切片HE染色对照表明，mGluR5强阳性神经元多为缺血较重的神经元。提示在缺血性脑血管病的自然病程中，mGluR5参与了缺血性脑损伤的进展。我们的研究表明，正常组与各假手术组无差异，说明单纯的手术操作对mGluR5的表达无明显影响。mGluR5在脑缺血后逐渐升高，至12h达到高峰，这也说明mGluR5可能在继发性神经元损伤中可能发挥着重要的作用。结合以前的研究结果，即血液和脑脊液中的Glu在缺血性脑血管病中升高[9-10]，我们推测mGluR5的升高也可能是一种为清除Glu而作出的反应性增高，是一种自体平衡的自我保护机制，而mGluR5对Glu的过度摄取反而对机体是另一种损伤，Bao等[11]用mGluR5的拮抗剂和激动剂治疗脑缺血都有作用，可能也证明了这一点，但目前我们没有更多的证据。若从这一点来看，我们对谷氨酸兴奋性毒性的抑制应该集中在怎样去灭活生成过多的Glu上。除开发其受体激动剂或拮抗剂阻止其活化谷氨酸受体发生级联性损害外，还应关注其生成的途径。

　　【参考文献】

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　　[4] Phillips JM, Lam HA, Ackerson LC,et al.Blockade of mGluR glutamate receptors in the subthalamic nucleus ameliorates motor asymmetry in an animal model of Parkinson's disease[J].Eur J Neurosci,2006,23(1):151-160.

　　[5] Cortese BM,Phan KL.The role of glutamate in anxiety and related disorders[J].CNS Spectr,2005,10(10):820-830.

　　[6] Niswender CM,Jones CK,Conn PJ.New therapeutic frontiers for metabotropic glutamate receptors[J]. Curr Top Med Chem, 2005,5(9):847-857.

　　[7] Romano C, Sesma MA, McDonald CT, et al.Distribution of metabotropic glutamate receptor mGluR5 immunoreactivity in rat brain[J].J Comp Neurol,1995,355(3):455-469.

　　[8] Pin JP, Duvoisin R.The metabotropic glutamate receptors: structure and functions[J]. Neuropharmacology,1995,34(1):1-26.

　　[9] 杨巧莲,张茂林,郑俊婷,等.急性脑梗死患者神经功能受损程度与血清谷氨酸水平的动态变化[J].中国临床康复,2005,9(13):96-97.

　　[10] 张中兴,卢红,张萍,等.脑梗死后血、脑脊液中兴奋性氨基酸变化与神经功能缺失的关系[J].中国临床康复,2003,7(25):3422.

　　[11] Bao WL,Williams AJ,Faden AI,et al.Selective mGluR5 receptor antagonist or agonist provides neuroprotection in a rat model of focal cerebral ischemia[J].Brain Res,2001,922(2):173-179.