大鼠严重胸部创伤肺泡巨噬细胞TLR4的表达及意义

作者：张伟，蒋耀光，吕凤林，胡承香，李磊

【关键词】  胸部创伤

　　摘要：  目的  观察大鼠严重胸部创伤后肺泡巨噬细胞TLR4基因及蛋白表达水平的变化，并探讨其意义。方法  建立大鼠严重胸部创伤模型，支气管肺泡灌洗分离、培养肺泡巨噬细胞，利用Western、Northern分子生物学技术检测创伤前、创伤后2、4、8、16、24小时肺泡巨噬细胞TLR4的表达水平。结果  利用小型多功能生物撞击机，以400kPa驱动压力对大鼠右侧上胸壁进行致伤，可建立稳定可靠并符合临床特点的严重胸部创伤动物模型；严重胸部创伤可上调TLR4在肺泡巨噬细胞内的表达，表达高峰在伤后8小时，伤后24小时恢复正常。结论 TLR4的上调参与了创伤后失控性炎症反应的病理生理过程。本研究为创伤性急性肺损伤的发病机制提供了一定的实验及理论依据。

　　关键词：胸部创伤；肺泡巨噬细胞；Toll样受体4；内毒素；肺损伤；大鼠

　　Change of Tolllike receptor 4 expression on alveolar macrophages in severe thoracic trauma in rats

　　ZHANG Wei,JIANG Yaoguang,LV Fengling,et al.

　　(Thoracic and Cardiovascular，Surgery Research Center,Institute of Surgery Research,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing  400042,China)

　　Abstract：  Objective  To observe the changes of alveolar macrophages on TLR4mRNA and expression of TLR4 protein.Methods  Models of severe thoracic trauma were established,alveolar macrophages were obtained by collecting bronchoalveolar lavage fluid,and then separated and cultured.TLR4mRNA and the expression of TLR4 protein were measured by northern and western blot before and 2,4,8,16,24h after trauma.Results  A stable and reliable severe thoracic trauma model was successfully established with 400kPastrike on the upperright part of chest of the rat by a multiplefunction strike apparatus.The expression of TLR4 could be upregulated after trauma,and the highest expression of alveolar macrophages occurred 8,24h after injury.Conclusion  The upregulation of TLR4 participated in the pathological procedure of excessive inflammation.The present study presented the valuable laboratoy and theoretical evidence for the research of ALI caused by severe thoracic trauma.

　　Key words:thoracic trauma;alveolar macrophages;TollLike Receptor 4;LPS;lung injury；rats

    严重胸部创伤常并发创伤性急性肺损伤(acute lung injury，ALI)，并极易发展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。尽管对ARDS的研究已有30余年，但ARDS死亡率仍较高，其发病机制仍不清楚。对其发病机制的探讨是当今创伤研究领域的热点之一，也是临床工作中迫切需要解决的课题。有关研究表明，严重胸部创伤能引起机体内毒素（LPS）升高。新近发现的TLR4（Tolllike receptor 4）是Toll家族成员之一，被认为是LPS胞内信号转导的重要通路。TLR4启动的胞内信号转导最终激活NFκB，从而诱导肺泡巨噬细胞（AM）产生免疫炎性细胞因子，或扩大非特异性防御反应，或诱发特异性免疫，因而是极为重要的天然免疫受体。将其应用于创伤研究领域，对阐明ALI的发病机制无疑具有重要科学意义，也为调控创伤后的免疫紊乱状态，防治创伤并发症提供理论基础。

　　材料与方法

　　1  动物模型及动物分组

　　Wistar大鼠(第三军医大学动物研究所提供)，雌雄不拘，体重150～200g。随机分为对照组（n＝3）及创伤组（n＝15），致伤前12小时禁食、自由饮水。对照组单纯麻醉不致伤。创伤组乙醚吸入麻醉后，左侧45°卧位，采用小型多功能生物撞击机以400kPa驱动压力撞击腋前线第4肋间。致伤后，动物参照器官损伤定级（OIS）和AIS90标准以及死亡率并结合电镜观察，判定其损伤程度。

　　2  AM的分离与培养

　　采用支气管肺泡灌洗法。分别对对照组、创伤后2、4、8、16、24小时活杀动物提取AM。将收集到的AM 1000r/min离心10分钟后弃上清，用RPMI  1640完全培养液重悬、混匀，置于直径9cm的硅化玻璃培养皿内，5％CO2、37℃、饱和湿度条件下培养1小时，用温PBS洗去未粘附细胞(至少3次)，并用0.25％胰酶消化后加入RPMI  1640完全培养液并反复吹打贴壁细胞，收集于无菌硅化试管中，1000r/min离心10分钟后弃上清，用RPMI  1640重悬，调细胞浓度为1×106/ml，将所得细胞再分为LPS－组及LPS+组，LPS终浓度为l00ng/ml，继续培养2小时。重悬并沉淀细胞，－70°C贮存待用。

　　3  电镜观察

　　取创伤后大鼠8只，分别于伤后8、24小时剖胸，观察记录肺部大体病理改变。留取致伤大鼠挫伤区(右肺上叶)肺组织，标本取材后，立即切成1mm3大小，以0.3％戊二醛固定，再用1％的四氧化锇固定，梯度丙酮脱水后，环氧树脂包埋，行超薄切片，透射电镜观察。

　　4  细胞总RNA提取、测定

　　采用改良异硫氰酸胍法［1］行细胞总RNA和巨噬细胞核蛋白提取，蛋白定量按Lorry法测定，－20°C保存。

　　5  Western  Blot检测TLR4蛋白表达

　　上样量为40μg／泳道。将留取的待测标本加入2×SDS凝胶加样缓冲液，在100℃变性3分钟，迅速放入冰中冷却，顺序加样，经4％积层胶在80V电压下电泳约30分钟，然后经12％分离胶在100V电压下电泳约2小时，取下分离胶进行电转印。半干转膜仪（BioRad）20V恒压转移12小时后取出。转印后的PVDF膜用于杂交，用封闭液在37℃水浴箱内封闭2小时，将膜用PBS摇洗15分钟×2次，加入TLR4抗体(1：200稀释，SantaCruz)，37℃孵育1小时，将膜与辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1：5000稀释，SantaCruz)在37℃下孵育1小时，然后与X线胶片共同放入暗盒内曝光30秒～10分钟，常规显影、定影。

　　6  Northern Blot检测TLR4 mRNA表达

　　总RNA按前述方法提取后，取1μl RNA样品，稀释100倍，在260nm和280nm比色，260nm/280nm的值在1.6～2.0之间可用于Northern杂交。然后行RNA甲醛凝胶电泳和转膜，样品RNA每孔10μg，电泳70V，4.5小时。根据Star程序软件设计大鼠的TLR4探针为：TATCATCAGTGTATCGGTGGTCAGTGTGCTTGTGGTAG，标记探针用放射性核素α32P。电泳完毕后将RNA转移到尼龙膜上，在20×SSC中漂洗去掉膜上的凝胶，晾干后，80℃烘烤2小时。将膜置于杂交袋中,加入杂交液，42℃水浴中预杂交3小时。杂交完毕后，于暗盒内压上2张X线片，置-70℃放射显影。

　　7  统计学处理

　　所有图像数据采集和分析用UVP BioImaging系统和Lab Works3.0软件进行，将X线胶片扫描后的图像数据输入Lab Works  3.0图像分析系统，测定各目的条带的积分光密度值，并对3次结果的平均值进行统计学分析。实验中所有数据均以±s表示，每两组之间的计数资料比较采用χ2检验；每两组之间的计量资料采用t检验。

　　结果

　　1  采用该致伤模型，伤后大鼠出现呼吸急促、口唇发绀、苏醒延迟、精神萎靡、食欲减退、活动减少、毛发竖立等表现，部分大鼠口鼻出现血性分泌物，少数大鼠还出现寒战。平均AIS评分为4.15±0.24，OIS在较重与重度范围，1小时死亡率为40％，24小时死亡率为52％。电镜下见毛细血管内红细胞淤滞，炎细胞与血管内皮细胞粘附、Ⅱ型上皮细胞水肿，板层小体脱颗粒、空泡化，数目减少，细胞核固缩、核周间隙增大。肺泡腔内见中性粒细胞、单核巨噬细胞和大量红细胞渗出，达到严重胸部创伤程度。

　　2  创伤后2小时，AM细胞TLR4蛋白表达水平开始升高，伤后8小时到达高峰，随后降低，24小时恢复至正常水平，复合LPS刺激(AML)其变化趋势相似。对照组单纯LPS刺激上调了TLR4蛋白的表达，见表1、图1。

　　3  创伤后AM细胞TLR4基因表达水平2小时开始升高，伤后8小时到高峰，随后降低，24小时恢复至正常水平，复合LPS刺激(AML)其变化趋势相似。对照组单纯LPS刺激上调了TLR4基因的表达，见表2、图2。

　　表1  对照组与创伤组(不同时相点)TLR4蛋白表达变化(略) 　　　　与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；AML与AM比较：#P＜0.05

　　表2  对照组与创伤组(不同时相点)TLR4 mRNA表达变化(略)  

　　与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；AML与AM比较：#P＜0.05

　　1、2、3、4、5、6泳道分别代表对照组及创伤组伤后2、4、8、16、24小时TLR4蛋白表达；7、8、9、10、11、12泳道代表对应时相点复合LPS刺激TLR4蛋白表达

　　图1  对照组与创伤组肺泡巨噬细胞TLR4蛋白表达变化（略）

　　1、2、3、4、5、6泳道分别代表对照组及创伤组伤后2、4、8、16、24小时TLR4 mRNA表达；7、8、9、10、11、12泳道代表对应时相点复合LPS刺激mRNA表达(第二行为内标)

　　图2  对照组与创伤组肺泡巨噬细胞TLR4mRNA表达变化（略）

　　讨论

　　随着社会工业化进程的加快以及交通的日益发达，创伤的发病率不断增加，而且伤情、伤类也更为复杂。据WHO的统计资料，全球每年因创伤致伤人数约千万人，其中胸部创伤占创伤病例15％，而严重胸部创伤死亡率在25％左右［2］。Bardenheuer等［3］对2069例创伤病人流行病学进行了调查，其中交通伤达56.7％，胸部创伤最多见，占44.5％。因此，严重胸部创伤是目前创伤医学中亟待攻克的医学难题之一。

　　严重胸部创伤一方面可以直接造成肺组织损伤，另一方面可以导致全身炎症反应综合征，两者互为因果，最终引发ALI，并进而发展为ARDS。现认为ALI与ARDS是同一病理过程中的两个不同阶段，ARDS是ALI的晚期表现［4］，至今对ALI的发病机制尚不明确，对严重胸部创伤继发的ALI的深入研究需要稳定可靠并符合临床特点的动物模型。本研究用400kPa驱动压力对大鼠进行致伤，半数大鼠存活至伤后24小时以上，其肺部伤情在较重与重度范围内，平均AIS分值为4.15；病理检查发现撞击侧肺(右上肺)可致肺泡腔及间质内广泛出血，肺泡结构被破坏并有白细胞及单核巨噬细胞浸润，血管内皮有炎细胞粘附，说明本模型是一种较好的对严重胸部创伤进行研究的动物模型。

　　作为重要的免疫细胞，肺泡巨噬细胞是肺部炎症发生的调控中心，其表面受体表达及其对致炎因子的识别在SIRS发生和发展中具有重要作用。在严重创伤、感染情况下，单核/巨噬细胞活化，引起多种炎症介质大量、持续释放，导致SIRS，研究表明炎症反应的启动有赖于模式识别受体(patternrecognition receptors，PRRs)对病原体的保守分子(pathogenassociated molecular patterns，PAMPs)的识别［5］。TLR4是典型的模式识别受体，主要表达于单核巨噬细胞，识别内外源性致炎因子，介导肺部炎症反应［6］。本研究发现，创伤能上调TLR4蛋白和基因水平，AM在伤后2小时开始增加，表达高峰在伤后8小时，随后降低，伤后24小时恢复正常，但复合内毒素攻击并未改变其变化趋势。这种现象可能与我们使用LPS剂量过小有关。Liu等［7］也认为高浓度的LPS才能使TLR4 mRNA表达上调。大量研究表明，TLR通路是由几个蛋白质复合物介导的，第一个复合物包括活性TLRs、接头分子MyD88以及IRAK，被激活的TLR4复合物由TRAF6(肿瘤坏死因子相关因子6)介导，最终激活NFκB，引起TNFα、IL1、IL6等开放效应基因的转录［8］。因此，胸部创伤后TLR4表达上调引起大量炎症因子活化、转录以及大量合成、释放，形成炎症反应，以清除外来病原体。创伤后巨噬细胞TLR4表达上调，是免疫系统对胸部创伤和应激的一种反应，甚至是机体在细胞、组织、器官系统乃至整体水平对致炎因子的敏感性增强，这可能对机体造成双向性影响：一方面是机体的防御反应增强，有利于机体抵御各种感染；另一方面，导致机体易于发生炎症反应、SIRS甚至MODS。

　　Paterson等［9］在小鼠烫伤模型的实验中观察到烫伤后3小时未发现TLR4表达增加，而出现在伤后第1天，相比我们结果其表达延迟，推测与创伤模型、创伤程度不一致有关。Paterson等同时还发现，伤后早期脾脏巨噬细胞表面TLR4平均密度显著增加，同时增强了TLR4对LPS的敏感性。结论提示，TLR4作为模式识别分子，不仅能够识别外来病原体，也能识别和介导内源性刺激因子，它的这种生物学特征对于创伤研究具有重要意义，因为创伤导致机体大量坏死组织产生，从而触发内源性TLR4刺激，如HSP60，细胞坏死后所释放的蛋白，也能引起TLR4的转录［10］，TLR4通过识别这些危险信号而启动自身转录，诱发炎症反应。

　　参考文献：

　　［1］熊仁平，刘萍，周元国，等.从少量培养细胞中同时提取微量蛋白和RNA的方法［J］.中国生物化学与分子生物学报，2003，19(2)：256-260.

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　　［4］石应康.急性肺损伤的研究进展［J］.中华创伤杂志，2000，16(11)：645-647.

　　［5］Medzhitov R,Preston HP,Janeway CA,et al.A human homologue of the Drosophila toll protein signals activation of adaptive immunity［J］.Nature,1997,388(6640):394-397.

　　［6］Akira S,Hemmi H.Recognition of pathogenassociated molecular patterns by TLR family［J］.Immunol Lett,2003，85(2):85-95.

　　［7］Liu Y,Wang Y,Yamakuchi M,et al.Upregulation of Tolllike receptor 4 gene expression in macrophage response to peptidoglycan high concentration of lipopolysaccharide is involved in NF-κB activation［J］.Infect Immun,2001，69(5):2788-2796.

　　［8］Poltorak AH,Xialong H,Sminova I,et al.Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice:mutations in TLR4 gene［J］.Science,1998,282(5396):2085-2088.

　　［9］Paterson HM,Murphy TJ,Purcell EJ,et al.Injury primes the innate immune system for enhanced Tolllike receptor reactivity［J］.J Immunol,2003，171:1473-1483.

　　［10］Ohashi K,Burkart V,Flohe S,et al.Cutting edge:heat shock protein 60 is a putative endogenous ligand of the Tolllike receptor4 complex［J］.J Immunol,2000，164:558.