对氧磷酶2 C311S基因多态性与脑梗死的关系

　　作者：赵真 包正军 许宏伟 肖 波 杨晓苏 杨期东 作者单位：(湖南株洲市一医院神经内科，湖南 珠洲 412000)

　　【摘要】 目的 探讨对氧磷酶 2(paraoxonase 2, PON2)基因多态性与湖南地区人群脑梗死的关系。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法(PCRRFLP)探查 PON2基因C311S多态性在脑梗死组和正常对照组的基因频率。结果 发现湖南地区人群存在 PON2 C311S基因多态性， S /C等位基因频率 0.727/0.273。脑梗死患者 PON2基因C311S的基因型和等位基因频率与正常对照组相比无显著差异 (P>0.05)。脑梗死组CC基因型HDL水平明显低于SS、CS两型(P<0.05)。结论 PON2基因第311位密码子的多态性与湖南地区人群脑梗死的发病无关，而可能与脑梗死患者的高密度脂蛋白水平有关。

　　【关键词】 脑梗死;对氧磷酶2;基因多态性

　　许多研究证实高密度脂蛋白(HDL)具有多种抗动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的性质,而HDL防止AS始动过程主要是通过其特有的抗氧化酶-对氧磷酶1(Paraoxonase1,PON1)实现的,对氧磷酶家族从而得到广泛关注。PON基因家族位于7号染色体长臂21.3～22.1区,由PON1、PON2和PON3 3个基因组成〔1〕。PON2是这个的家族的第二个成员，分别在位点311和148拥有基因多态性〔2〕。目前研究认为PON2具有广泛的抗细胞氧化作用，也就是具有抗AS作用。脑梗死与AS关系密切，但PON2与脑梗死的关系如何，关于PON2基因C311S多态位点与脑梗死的关系少见报道〔3〕，与湖南地区人群脑梗死关系的研究尚未见报道。本文采用病例对照研究,探讨PON2基因C311S多态性在湖南地区人群中的分布情况及其与脑梗死的关系。

　　1 资料和方法

　　1.1 对象 收集湖南汉族脑梗死患者血标本180例，经临床及 CT和(或)磁共振成像(MRI)确诊(依照第四届全国脑血管病学术会议诊断标准)，不包括心律失常、动脉炎、外伤、血液病、药物、肿瘤、脑血管畸形或动脉瘤等引起的脑梗死 ;排除蛛网膜下腔出血，肝、肾疾病，自身免疫性疾病，妊娠者，半年内曾有降脂治疗者。对照组为湖南汉族健康体检者120例，排除脑血管病，脑血管病家族史，肝、肾、血液、自身免疫性疾病，妊娠，半年内有降脂治疗者。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试剂 dNTPs、TaqDNA 聚合酶、DNA 片段长度标记物均由深圳晶美生物工程有限公司提供加拿大 MBI公司的产品;限制性内切酶由美国 Promega公司提供 ;琼脂糖购自北京鼎国生物公司。

　　1.2.2 引物 PCR引物参照文献〔4〕,序列为:上游引物：5′tgggtcaatgttgctggtta3′,下游引物：5′catgcatgtacggtggtctt3′，由深圳英骏生物技术有限公司合成。

　　1.2.3 DNA的制备及PCR扩增、基因型分析 (1)基因组 DNA的制备:采外周静脉血2～3 ml用明胶沉淀红细胞，提取白细胞后用酚/氯仿抽提其中的基因组 DNA。(2)目的基因的 PCR扩增: 94℃预变性240 s,94℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸50 s，共反应30循环。72℃终末延伸5 min，最后置于4℃终止反应。4℃冰箱保存。(3)PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，溴化乙锭染色，凝胶电泳成像分析系统内观察。PCR产物长度为299 bp。PONC311S多态性由内切酶DdeI识别，37℃消化2～4 h。酶切产物用琼脂糖凝胶(含溴化乙啶)电泳分离,紫外灯下照相后阅读效果。

　　1.3 统计学分析 统计学分析采用 SPSS11.0软件包，等位基因频率=(2×纯合子+杂合子)/(2×受检人数)。组间等位基因和基因型频率的差异用χ2检验。计量资料两组比较用t检验，两组以上用方差分析。计算每组基因型频率及等位基因频率，经计算符合 HardyWeinbery平衡定律，样本具有群体代表性。

　　2 结 果

　　2.1 PON2基因C311S的PCR扩增产物限制性内切酶片段长度多态性 见图1。PON2基因第九号外显子第311位密码子发生TCT→TGT突变，导致编码氨基酸由丝氨酸(serine,S)转变为半胱氨酸(cysteine，C),失去DdeI酶切位点。PON2基因C311S的PCR产物酶切后拥有74、67、128、30 bp四条碱基片段的是SS型纯合子;拥有141、128、30 bp三条碱基片段的是CC型纯合子;拥有30、74、67、128、141 bp五条碱基片段的是CS型杂合子。

　　图1 PON2基因C311S的PCR扩增片段

　　2.2 两组一般情况 见表1。病例组与对照组相比，在年龄、性别、吸烟史、饮酒史方面均无显著性差异;脑梗死组与对照组在高血压病史、糖尿病史方面有显著差异。表1 两组一般情况与对照组比较：1)P<0.05

　　2.3 健康群体PON2基因C311S基因多态性分布 见表2。将中国湖南地区的PON2基因C311S基因型和等位基因频率分布分别与印度人、日本人、美国白人、美国黑人、中国湖北、广东、广西、北京地区的人群相比，发现与印度人、北京人均有显著差异(P<0.05)，其他无显著差异(P>0.05)。表2 PON2基因C311S基因型和等位基因频率分布及 与其他种族、地区人群比较

　　与中国湖南PON2基因C311S基因型比较：1)P<0.001;与中国湖南人PON2基因C311S等位基因频率比较：2)P<0.05

　　2.4 脑梗死组与对照组PON2基因C311S多态分布 见表3。SS、CS、CC三种基因型在脑梗死组和对照组的分布都以SS基因型频率最高，CC型最低。PON2基因C311S三种基因型频率分布两组间无显著性差异，两种等位基因频率两组相比亦无显著性差异。表3 脑梗死组与对照组PON2基因C311S多态分布

　　2.5 脑梗死组PON2基因C311S多态分布对血糖、血脂水平的影响 见表4。脑梗死组各基因型亚组间血糖、血脂、脂蛋白水平比较只有高密度脂蛋白有显著性差异(P<0.05)- CC基因型HDL水平明显低于SS、CS两型，其余未见显著性差异。表4 脑梗死组PON2基因C311S基因型 亚组间血糖、血脂的比较

　　3 讨 论

　　近年来PON基因家族因其中的PON1是HDL抗AS作用的重要因素而成为人们的研究热点，已有很多研究证实PON基因家族具有抗氧化、抗动脉粥样硬化的作用。

　　本研究发现中国湖南人存在PON2基因 C311S多态性，其中以SS基因型最为多见，基因型和等位基因频率的总体分布趋势与国内报道的大部分华人和美国白人、黑人、日本人群相一致，只与印度人和北京人有显著性差异。其分布与印度人有显著性差异，考虑与种族有关，与赵伟佳等〔3〕的研究结果一致;但是与同一种族的北京人群也有差异，而与白人、黑人没有显著差异，关于这一点本文认为除了要考虑与地域、环境、饮食等的影响外，是否与研究的样本量仍是不够有关。

　　目前很多研究表明PON2基因多态性可以影响血脂和血浆脂蛋白水平，Abbott等〔10～13〕研究发现PON2基因突变与血脂、血浆脂蛋白明显相关。Mackness等〔14〕也报道在2型糖尿病合并视网膜病变患者中PON2 311CC可引起显著的血糖控制不良。

　　邵海琴等〔7〕 研究认为PON2基因C311S在冠心病组其SS基因型血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)水平显著低于正常对照组。王晓艺等〔4，15〕研究认为心肌梗塞患者PON2C311S基因多态性与血脂、血浆脂蛋白水平无关。

　　本文的研究表明脑梗死组中3个基因型间的高密度脂蛋白水平有显著性差异，CC基因型的HDL显著低于其他两种基因型，因此认为PON2基因C311S基因多态性可能与脂蛋白的代谢有关。提示PON2多态性影响血脂水平除了已知的三种可能外〔16〕，还可能与近年来的新发现有关。近来的研究发现人类的巨噬细胞中仅有PON2表达，而且在氧化反应中其表达是上调的〔18〕，这导致巨噬细胞脂质过氧化物含量减少，使巨噬细胞氧化反应下降，更能阻止泡沫细胞形成〔19〕。PON2可能象PON1一样，通过水解一定的细胞氧化脂质防止脂质过氧化〔20，21〕。因此，可以认为PON2本身具有与PON1类似的作用，从而与HDL作用表达一致，表现在CI组中三种基因型的HDL水平具有明显的差异。本研究中发现在在脑梗死组、对照组之间PON2基因C311S基因型分布和等位基因频率没有显著性差异。但是，王晓艺等〔4〕认为中国人2型糖尿病患者PON2基因第311位密码子的多态性与并发脑梗死相关，赵伟佳等〔3〕认为中国人脑梗死患者PON2基因第311位密码子的多态性与脑梗死的遗传学基础有关，结果与本研究结果不同。而Imai等〔6〕对日本人群的研究结果显示,PON2基因C311S多态性与脑梗死无关，新近研究表明，心肌梗死患者PON2基因多态性与脑卒中无关，只有PON1与脑卒中有关〔15〕。这两个结论与本文一致。

　　以往报道结论不一致，我们推测可能与下列因素有关：1.尽管我们的结果提示PON2基因C311S可能与脑梗死患者的HDL代谢有关，但是影响较小，以致不能影响脑梗死的发生或预后，从而表现为无关。2.PON2基因多态性分布在不同种族、地区的正常人群中因遗传背景、环境而有很大差异，甚至导致改变了其基因产物的作用和/或作用的方式。这种改变在脑卒中人群中更可能因个人素质、高危因素等干预而加剧。3.还可能与种族差异和研究方法的因素如取样、样本量大小等有关联。这些都可使PON2基因C311S位点多态性与脑卒中的关系表现为并不一致。

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