聚乙烯亚胺－肝素结合医用聚氯乙烯材料的肝素释放速率研究

作者:杨剑,易定华,段维勋

作者单位：1.第四军医大学西京医院心脏外科,陕西 西安 710032;2.西安交通大学应用化学系，陕西 西安 710049

  【摘要】  　　目的 评价聚乙烯亚胺－肝素结合处理的聚氯乙烯(PVC)材料的肝素释放速率。方法 应用聚乙烯亚胺－肝素结合方法，对医用聚氯乙烯材料进行肝素结合处理，同时通过甲苯胺蓝分光光度法评测肝素的释放速率。结果 应用聚乙烯亚胺－肝素结合方法所处理的聚氯乙烯材料表面肝素含量为400～700 μg/cm2，于生理盐水中浸泡700 h后，聚乙烯亚胺－肝素涂层的PVC表面的肝素脱落率为0.89%。结论 聚乙烯亚胺－肝素结合方法涂层的稳定性良好，几乎没有肝素游离脱落，可满足心脏外科体外循环手术的需求。

【关键词】  聚乙烯亚胺 聚氯乙烯肝素涂层

　　Heparin Releasing Rate Evaluation of

    Heparin Coated Modified Polyvinyl Chloride Material

    YANG Jian1,YI Ding-hua1,Duan Wei-xun1,Liu Jian2,

    Cao Rui-jun2,XU Xue-zeng1,WEI Xu-feng1

    (1.Deptartment of cardiovascular surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University,

    shaanxi Xi'an 710032, China; 2.Deptartment of applied chemistry,

    Xi'an Jiaotong University,shaanxi Xi'an 710049,China)

    Abstract: OBJECTIVE   To evaluate the heparin releasing rate of polyethyleneimine-heparin coated polyvinyl chloride (PVC) medical material. METHODS  By using polyethyleneimine -heparin coating technique, PVC material of medical grade was coated with heparin. Then the concentration of coated heparin was calculated and heparin releasing rate was evaluated by toluidine blue spectrophotometry. RESULTS  The heparin concentration on polyethyleneimine -heparin coated PVC surface was 400 to 700 μg/cm2. After soaked in saline for 700 hours, the heparin releasing rate of the polyethyleneimine-heparin coated PVC material was only 0.89%. CONCLUSION  The polyethyleneimine-heparin coated PVC material has good heparin releasing stability and low heparin releasing rate,it can meet the requirement of cardiopulmonary bypass use in heart surgery.

    Key words：  Polyethyleneimine;Polyvinyl chloride;Heparin coating

    医用聚氯乙烯材料因具有良好的物理性能而在临床上得以广泛应用，包括各种输液、输血设备，体外循环管道等。近年的研究表明，通过在人工材料表面涂覆肝素可有效改善人工材料的血液、生物相容性，减轻术后的全身炎性反应［1-2］。在国家“十五”科技攻关计划资助项目的资助下，我们与广东东莞科威有限公司协作，改良了医用聚氯乙烯的配方，制备了胸腔镜体外循环动、静脉插管，同时利用聚乙烯亚胺－肝素（PEI-H）涂层方法进行了材料的肝素结合处理。本研究通过甲苯胺蓝分光光度法测定了肝素结合医用聚氯乙烯材料的肝素分子释放速率，评价了该方法肝素分子结合的稳定性。

    1  材料和方法

    1.1  聚氯乙烯材料  医用聚氯乙烯材料选用自行研制的胸腔镜体外循环静脉插管，其组成配方包括：PVC树脂、Kxt、ESBO、CaST、液体钙锌、亚磷酸脂、细SiO2等。将静脉插管材料用模具刀切割成0.7cm×0.7cm大小备用。

    1.2  聚乙烯亚胺－肝素结合  取质量分数为30% 的聚乙烯亚胺水溶液（平均相对分子量5万单位）16.7 ml，加入1,1,2-三氟三氯乙烷2.5 ml，25％戊二醛0.8 ml，无水乙醇80 ml，于37℃下配制5%聚乙烯亚胺乙醇溶液。将医用聚氯乙烯材料块浸泡于5%聚乙烯亚胺乙醇溶液中30 min，再放入质量分数1% (pH=1)肝素水溶液中，37℃中水浴30 min后倒出剩余溶液，重复以上步骤3次，得到PEI-H结合的改良聚氯乙烯材料，干燥后备用［3］。

 1.3  肝素标准曲线的绘制  配置一系列标准浓度的肝素溶液，与精确等量的甲苯胺蓝反应，通过测定反应后剩余甲苯胺蓝溶液在631nm处的吸光度，绘制肝素标准浓度工作曲线，待测浓度肝素溶液与等量的甲苯胺蓝反应后，读取反应后甲苯胺蓝在631nm处的吸光度值，由标准工作曲线即可求出游离肝素的浓度。

    1.4  肝素结合表面肝素含量的测定  通过两步甲苯胺蓝分光光度法测定。首先测定肝素结合表面PEI-H复合物测定含量：由于PEI-H复合物的无水乙醇溶液在221 nm处有最大吸收峰。将涂层表面的PEI-H复合物用无水乙醇完全洗脱，在221nm处测定其吸光度，通过与标准浓度PEI-H复合物的工作曲线比较，便可以得到涂层表面PEI-H复合物的含量。再进行PEI-H复合物中的肝素含量的测定：取一定量的聚乙烯亚胺与过量肝素反应，反应前后溶液中游离肝素含量的差值便是固定于PEI-H复合物中的肝素含量。游离肝素含量通过甲苯胺蓝法测得。测得涂层表面的PEI-H复合物含量后，由PEI-H复合物中肝素含量即可求得表面肝素含量。

    1.5  肝素释放速率的测定  将已经过PEI-H涂层处理的PVC材料室温下浸泡于生理盐水中制备浸提液。在不同的浸泡时间取样，用甲苯胺蓝法检测浸提液中的游离肝素量，除以肝素结合表面的肝素含量，即可计算肝素分子的释放速率。

    2  结  果

    2.1  标准浓度肝素工作曲线的绘制  甲苯胺蓝分光光度法是利用甲苯胺蓝在631nm处有最大吸收峰的特性，通过比较吸附前、后甲苯胺蓝在631nm处吸光度的差值，间接得到肝素含量。通过甲苯胺蓝反应测定的肝素含量在0～70 μg范围内与吸光度具有良好的正相关性，回归系数R = 0.999，通过这种方法能够精确测量溶液中游离肝素的含量。见图1。注  Abs=0.00458*Con+0.000583  R=0.999

    2.2  涂层表面肝素含量及肝素释放速率的测定  通过两步甲苯胺蓝分光光度法测定，应用PEI-H结合方法所处理的聚氯乙烯材料表面肝素含量为400～700 μg/cm2。于生理盐水中浸泡700 h后，PEI-H涂层的PVC表面的肝素脱落率为0.89%。见表1。

    3  讨  论

    医用聚氯乙烯是临床上应用广泛的一种人工合成材料，包括各种输液、输血设备，体外循环管道等。与其他人工合成材料一样，医用聚氯乙烯虽然具有良好的物理性能，但血液、生物相容性欠佳，尤其是 表1  PEI-H涂层的肝素释放速率

    与血液接触时候，会导致内、外源性凝血途径激活，形成微血栓并引起炎性和免疫排斥反应，释放有毒物质，影响治疗效果［4-5］。近年的研究表明，通过在人工材料表面涂覆肝素分子可有效改善其血液、生物相容性，减轻术后的全身炎性反应［6-7］。非生物材料表面肝素化的抗凝血机理，主要在于表面结合的肝素分子可以有效减少血浆蛋白粘附功能，一方面可防止血浆蛋白变性，另一方面在材料表面形成血液相容性的假膜（蛋白层），从而达到改善材料生物相容性的作用［8-9］。因而将肝素结合在体外循环高分子材料表面，形成肝素结合的体外循环设备，即（Heparin- coated circuits，HCC），改善其生物相容性，已经成为人们目前研究开发的中心和焦点。

    肝素复合物涂层的主要局限性是肝素结合不牢固，在血液环境中长时间冲刷后会有肝素脱落，从而影响其抗凝血活性。因此衡量一种肝素表面涂层技术的关键指标之一就是肝素涂层的稳定性。我们与广东东莞科威有限公司协作，对医用聚氯乙烯的配方进行了改良，同时还利用具有自主知识产权的聚乙烯亚胺－肝素共价键改性技术，对改良聚氯乙烯材料进行了肝素结合［3］。既往研究通过MTT等方法评价了肝素结合改良聚氯乙烯的细胞毒性以及肝素分子的抗凝活性，结果显示改良聚乙烯亚胺－肝素结合方法具有良好的抗凝血性能［10］，同时聚乙烯亚胺－肝素结合的方法未增加材料的细胞毒性，具有优异的细胞相容性［11-12］。本实验通过甲苯胺蓝分光光度法测定了聚乙烯亚胺－肝素涂层PVC材料表面肝素含量及肝素的释放速率，结果表明应用聚乙烯亚胺－肝素结合方法所处理的聚氯乙烯材料表面肝素含量为400～700 μg/cm2，于生理盐水中浸泡700 h后，聚乙烯亚胺－肝素涂层的PVC表面的肝素脱落率为0.89%。聚乙烯亚胺－肝素结合方法涂层的稳定性良好，几乎没有游离肝素脱落，可满足心脏外科体外循环手术的需求。

【参考文献】  　　［1］ Sperling C,Houska M,Brynda E,et al. In vitro hemocompatibility of albumin-heparin multilayer coatings on polyethersulfone prepared by the layer-by-layer technique［J］. J Biomed Mater Res A,2006,76(4): 681-689.

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［3］ 杨剑, 易定华, 刘金成,等. 肝素涂层体外循环管道的制备及生物学性能评价［J］. 中国生物医学工程学报,2004,2: 169-174.

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［11］ 杨剑, 易定华, 刘金成,等. Mtt法评价肝素涂层医用聚氯乙稀的细胞毒性 ［J］. 生物医学工程与临床, 2004, (1): 11-13.

［12］ 杨剑, 易定华, 刘金成, 等. 肝素涂层医用聚氯乙烯的细胞毒性研究 ［J］. 生物医学工程学杂志,2005,(4): 739-741.