超极化停搏对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响
发表时间：2009-06-27 浏览次数：841次
作者:曾志勇,杨胜生,程先进作者单位：1.解放军南京军区福州总医院心胸外科，福建 福州 350025；2.上海第二军医大学长海医院胸心外科，上海 200433
【摘要】 目的 观察超极化停搏对体外循环（extracorporeal circulation，ECC）中缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响，评价其对心肌的保护作用。方法 将75只健康家猫随机均分为3组。应用猫ECC模型。并行循环组：ECC建立后不阻断上、下腔静脉和主动脉，仅并行循环150 min；去极化停搏组：主动脉阻断(ACC)60 min，再灌注60min，心脏停搏液使用去极化高钾St.Thomas液；超极化停搏组：心脏停搏液使用含吡那地尔的低钾St.Thomas液，余处理与去极化停搏组相同。应用Annexin-V/PI联合染色、流式细胞仪检测心肌细胞膜磷脂酰丝氨酸的外翻，比较超极化停搏处理组及去极化停搏组ECC过程中心肌细胞坏死和凋亡的数量。结果 去极化停搏组于ACC 60min及再灌注60 min时坏死心肌细胞率分别为（2.727±0.436）%及（5.622±1.389）%；而超极化停搏组分别为（1.514±0.333）％和（3.052±0.403）％。两组 ACC 60 min时，均未检出凋亡心肌细胞，但在再灌注60 min时，去极化停搏组和超极化停搏组凋亡细胞率分别达（2.253±0.581）％和（0.875±0.232）％。超极化停搏处理组缺血再灌注期间坏死及凋亡的心肌细胞明显减少。结论 超极化停搏不仅能减少ECC缺血再灌注导致的细胞坏死，而且能够抑制再灌注期间发生的细胞凋亡。
【关键词】 体外循环 超极化停搏 心肌再灌注损伤 细胞凋亡；磷脂酰丝氨酸
Effect of Hyperpolarized Arrest on Apoptosis of Myocardial Cells
ZENG Zhi-yong1,YANG Sheng-sheng1,CHENG Xian-jin1,
ZHUANG Cong-wen1,HUANG Sheng-dong2，XU Zhi-yun2
（1.Department of Cardiothoracic Surgery,Fuzhou Genaral Hospital,Fujian Fuzhou 350025；
2. Department of Cardiothoracic Surgery,Changhai Hospital, Shanghai 200433, China）
Abstract: OBJECTIVE To elucidate the effect of hyperpolarized arrest on apoptosis of myocardial cells under ischemia/reperfusion during extracorporeal circulation (ECC). METHODS Seventy five felines were randomized into three groups: simply ECC group,depolarized arrest group and hyperpolarized arrest group. In simple ECC group,ECC was conducted without aortic cross-clamping (ACC). In depolarized arrest group and hyperpolarized arrest group, hearts underwent 60 minutes of global ischemia after ACC and infusion of cardioplegic solution(10ml/kg),followed by 60 minutes of reperfusion. The cardioplegic solution consisted of St.Thomas solution with KCl (16mmol/L) in depolarized arrest group or pinacidil(50mmol/L) in hyperpolarized arrest group. Apoptosis of myocytes was detected at the end of ACC and 90 min after beginning of reperfusion in all groups by flow cytometry with Annexin-V and propidium iodiode (PI) stainning. RESULTS In both depolarized arrest group and hyperpolarized arrest group, necrosis was found during either ischemia or reperfusion periods, but myocyte apoptosis was only detected during the period of reperfusion. Hyperpolarized arrest significantly decreased the ratio of necrosis myocytes both in ischemic and reperfusion periods during ECC（(2.727±0.436) %in depolarized arrest group vs (1.514±0.333)% in hyperpolarized arrest after 60 min ACC; (5.622±1.389)% in depolarized arrest group vs （3.052±0.403）% in hyperpolarized arrest group after 90 min reperfusion）. Moreover,hyperpolarized arrest markedly attenuated the ratio of apoptosis of myocardial cells caused by reperfusion from （2.253±0.581）% in depolarized arrest group to （0.875±0.232）% in hyperpolarized arrest. CONCLUSION Hyperpolarized arrest may protect myocardial cells from ischemia and reperfusion injury by inhibiting both necrosis and apoptosis during ECC.
Key words： Extracorporeal circulation;Hyperpolarized arrest；Myocardial reperfusion injury;Apoptosis;Phosphatidyl serine
体外循环（extracorporeal circulation, ECC）过程中的缺血再灌注可导致心肌细胞死亡，其中包括心肌细胞的凋亡［1］。如何早期发现并减少ECC过程中心肌细胞凋亡的发生，具有较为重要的临床意义。有研究［2］显示，细胞凋亡的发生伴有细胞膜磷脂酰丝氨酸（Phosphatidyl serine, PS）移位酶的激活，提示细胞膜膜脂双层的某些成分由胞浆面向细胞质面外翻(externalization)，可能是细胞凋亡的早期征象。本研究在猫ECC动物模型的基础上应用Annexin-V联合PI双染色法，检测心肌细胞膜PS的外翻，以观察超极化停搏(Hyperpolarized arrest)对ECC缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响，以期为超极化停搏的临床应用提供进一步的实验依据。
1 资料与方法
1.1 动物分组和主要试剂 健康家猫75只，体重（3.5±0.5）kg，雌雄不拘，由第二军医大学实验动物中心提供。根据随机数表将所有家猫随机均分为3组：并行循环组、去极化停搏组和超极化停搏组，每组各25只。
1.2 ECC模型的建立与标本采集 参照文献［2］的方法建立猫ECC模型并予以改进：使用戊巴比妥钠麻醉，气管切开呼吸机辅助呼吸，行主动脉及上、下腔静脉插管，放置左房引流管。ECC开始后辅助循环降温。并行循环组ECC建立后不阻断上、下腔静脉和主动脉，仅并行循环150 min；其余两组并行循环30 min后依次阻断上、下腔静脉和主动脉，同时经主动脉根部灌注心脏停搏液使心脏停搏。去极化停搏组心肌停搏采用标准4℃St. Thomas停搏液（K＋浓度16 mmol/L）；超极化停搏组采用4℃含吡那地尔（50 mmol/L）的低钾St.Thomas停搏液（K＋浓度5 mmol/L），两组总灌注量为10 ml/kg，灌注压80 mmHg。主动脉阻断（ACC）60 min后开放主动脉使心脏复跳，再灌注60min。各组ECC期间维持灌注流量（90.56±11.23）ml/（kg·min），灌注压（23.17±3.23） kPa(1kPa=7.5 mmHg)。各组总ECC时间为150 min。分别于ACC前、ACC 60 min和再灌注60min取左室心肌标本。制成组织匀浆备用。
1.3 心肌细胞制备 连同升主动脉摘取心脏，在无钙K-H液(NaCl 130 mmol/L，KCl 4.8 mmol/L， MgSO4 1.2 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，NaHCO3 2.5 mmol/L，Glucose 12.5 mmol/L，HEPES 12 mmol/L)中洗2次；结扎阻断升主动脉远心端，经冷晶体停跳液灌注管以无钙K-H液灌注心脏5min（8 ml/min）；以酶溶液I （胶原酶Ⅱ0.43 mg/ml,透明质酸酶0.3 mg/ml）50ml循环灌注心脏20min；再以酶溶液II（胶原酶Ⅱ0.43 mg/ml,透明质酸酶0.3 mg/ml，胰蛋白酶2 mg/ml,脱氧核糖核酸酶0.2 mg/ml）20 ml循环灌注心脏10 min；在含0.2％BSA和0.3 mmol/L CaCl2的无钙K-H液中，修剪心脏，去除心房、右心室，保留左室。将左室心肌剪成碎片，以针头轻轻划碎。清洗3次；15 min后，弃上清，以含0.6 mmol/L CaCl2的无钙K-H液清洗沉降细胞；10 min后以含1.0 mmol/L CaCl2的无钙K-H液清洗沉降细胞后备用。
1.4 凋亡细胞检测 应用Annexin-V-Fluos试剂盒（瑞士Roche公司）进行Annexin-V及PI标记，采用流式细胞仪检测心肌细胞膜PS外翻的情况, 计算凋亡及坏死心肌细胞的百分比。结果判定Annexin-V㈠/PI㈠为正常细胞，Annexin-V㈩/PI㈠为凋亡细胞，Annexin-V㈩/PI㈩为坏死细胞。
1.5 统计学处理 组间和组内均数的比较采用SPSS 10.0统计软件包进行方差分析(SNK法)，数据以均数±标准差(±s)表示。以P ＜0.05为相差显著，P ＜0.01为相差非常显著。
2 结 果
并行循环组随着ECC时间的延长，可检测到少量的坏死心肌细胞，但在各时间点均未检出凋亡细胞。
在ACC前，去极化停搏组和超极化停搏组坏死心肌细胞百分比分别为(0.214±0.057)%和(0.298±0.143)%,两者间无显著差异（P＞0.05）；两组均未检出心肌细胞凋亡。
去极化停搏组于ACC 60 min时，坏死心肌细胞率上升，再灌注60 min时，坏死细胞数进一步上升，与并行循环组相应时间点相比均明显增加（P<0.01）； ACC 60 min时，未检出凋亡心肌细胞。
超极化停搏组 ACC 60 min及再灌注60 min时，坏死和凋亡细胞率均明显少于去极化停搏组（P<0.01）；ACC 60 min时超极化停搏组亦未检出凋亡细胞，而且再灌注60 min时，凋亡细胞数也明显少于去极化停搏组（P<0.01），见表1。
3 讨 论
有研究［3］显示，细胞凋亡的发生伴有细胞膜PS移位酶的激活，提示细胞膜膜脂双层的某些成分由胞浆面向细胞质面外翻，可能是细胞凋亡的早期征象。
大量的研究［4］证明，ECC过程中的缺血再灌注损伤可导致心肌细胞的凋亡。尽管细胞凋亡被认为是受基因调控的程序性细胞死亡，但近来的研究发现，细胞凋亡与细胞膜的损伤也密切相关［5］。磷脂是构成细胞膜的重要成分，细胞膜脂质双层的不对称性是维持细胞生存和正常功能的前提条件。PS表1 各ECC组心肌凋亡细胞及坏死细胞百分比 (%,±s)
分组主动脉阻断 60min凋亡细胞坏死细胞再灌注 60min 凋亡细胞坏死细胞并行循环 0 0.345±0.117 0 0.686±0.221去极化停搏 0 2.727±0.436* 2.253±0.581 5.622±1.389*超极化停搏 0 1.514±0.333*△ 0.875±0.232* 3.052±0.403*△
注：*与并行循环组比较注P<0.01;△与去极化停搏组比较P<0.01
正常情况下位于细胞膜脂质双层的内表面，某些病理条件下，PS可由脂质双层的胞浆面向胞质面外翻。目前认为，PS外翻是细胞凋亡的早期表现，同时也是凋亡细胞被吞噬细胞和网状内皮系统识别和吞噬的靶点［6］。Annexin-V可与PS特异性结合，从而可被用于检测早期的凋亡细胞［7］，但由于坏死细胞PS亦暴露于脂质双层外表面，也可使Annexin-V结合阳性，因此，本研究选用Annexin/PI双参数法检测细胞凋亡。因为PI可与细胞坏死时释放出来的DNA结合使坏死细胞呈染色阳性，从而鉴别凋亡细胞与坏死细胞。
本研究结果显示，单纯ECC仅导致少量的心肌细胞死亡，说明不阻断主动脉、心脏不停搏状态下的并行循环对心肌细胞的损伤相对较轻。而去极化停搏组在缺血及再灌注期间，均发生较多的心肌细胞坏死，而且于再灌注60min时还检出了一定数量的细胞凋亡，提示ECC过程中阻断主动脉所致缺血再灌注可造成较为严重的细胞损伤。目前已证实钙超载和氧化应激是导致缺血再灌注相关细胞凋亡的重要因素［8］。PS外翻作为早期细胞凋亡特征性的表现，其机制可能是再灌注期间出现的钙超载激活了ATP非依赖型爬行酶（ATP-independently operating acramblase），加速膜内磷脂组分的双向运动，导致膜脂双层不对称性的丧失，使PS由胞浆面向外翻转而暴露于细胞表面；同时产生的大量氧自由基使PS氧化，也可促进其外翻［9］，最终影响细胞膜的形态及细胞正常功能的发挥。
以往的研究发现，ECC中常规应用的诸如低温、心肌保护液等心肌保护措施虽能减少心肌细胞的死亡，但对凋亡无明显的影响［10］。在本研究中，超极化停搏不仅明显减少了缺血再灌注导致的细胞坏死，还使再灌注期间的细胞凋亡率明显降低。其机制可能在于：吡那地尔可选择性地作用于ATP依赖的钾通道，使细胞膜K＋-ATP通道开放，从而促进K＋内流，使Ca2＋内流减少，从而减轻了因Ca2＋依赖性PLA2激活导致的磷脂降解。此外，超极化停搏使心肌细胞电活动和机械活动均处于完全静止状态，避免心肌的收缩和耗能的离子异常流动，减少了ATP的消耗，亦有利于减少膜脂质的降解［11］使细胞膜的结构和功能得到保护，从而减少细胞凋亡的发生。由此可见，与传统的去极化停搏相比，超极化停搏对ECC过程中缺血再灌注心肌细胞膜具有更加显著的保护作用。
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