食管鳞癌多阶段癌变中1433σ和P53表达特征及相关性分析

作者:齐义军,马远方,杜耀武

作者单位：河南大学： 1免疫学研究所2细胞与分子免疫学重点实验室　3淮河医院病理科4淮河医院胸心外科，河南 开封 475000　　5暨南大学生命与健康工程研究院，广东 广州 510632       【摘要】  　　目的： 探讨1433σ和P53蛋白表达在食管鳞癌和癌旁正常黏膜上皮、各级癌前病变中的变化特征及相关性. 方法： 采用免疫组织化学方法检测1433σ和P53蛋白在60例不同分化程度食管鳞癌和癌旁正常食管黏膜上皮、各级癌前病变中的表达变化. 结果： 癌旁正常食管黏膜上皮中均可检测到不同程度的1433σ蛋白表达（表达量8.22），随着癌前病变进展，1433σ的表达率和表达量逐渐下降；低分化鳞癌中1433σ的表达量最低（表达量0.45），完全失表达率为64%（7/11）. P53蛋白在鳞癌中表达率最高67%（27/40），表达量为4.86，而只有25%（6/24）癌旁正常上皮表达P53蛋白（表达量0.42）. 1433σ和P53蛋白的相关性分析表明二者呈显著负相关（P<0.05）. 结论： P53蛋白可能通过负调控1433σ基因的表达参与食管癌变多阶段演进过程，1433σ和P53可能成为食管癌早期诊断及高危人群筛查的分子指标，同时也可能成为食管癌生物预防和疗效评价的新靶点.

【关键词】  食管肿瘤；癌，鳞状细胞；1433σ；基因，P53；分子标记物

　　Characterization and correlation of 1433σ and P53 protein expressions in multistage carcinogenesis of esophageal squamous cell carcinoma

　　QI YiJun, MA YuanFang, DU YaoWu, LIU GuangChao, ZHANG LeiLei, ZHANG GuoMin, SHI GongNing,  ZHANG ShuangLin4, LI Yong4, HE ZhanFeng4, HE QingYu

　　1Institute of Immunology, 2 Key Laboratory of Cellular and Molecular Immunology, 3Department of Pathology, Huaihe Hospital, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Huaihe Hospital, Henan University, Kaifeng 475000, China,  5Institute of Life and Health Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China

　　【Abstract】AIM:  To characterize the 1433σ and P53 protein expressions during multistage carcinogenesis of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and in normal esophageal mucous epithelium.  METHODS:  Immunohistochemistry (ABC) methods were used to determine 1433σ and P53 protein expressions in 60 cases of ESCC, nearby matched normal esophageal epithelium and a variety of ESCC precursors. RESULTS:  High expression of 1433σ was found ubiquitously in normal esophageal epithelium with a digitalized average value of 8.22 in expression. Protein 1433σ was downregulated stepwise during the development of esophageal carcinoma from normal epithelium. Sixtyfour percent of poorlydifferentiated squamous cancer lost 1433σ expression with the digitalized value of 0.45. However, pattern of P53 protein expression was in contrast to 1433σ. Sixtyseven percent of esophageal cancer expressed P53 at a high level with a quantitated amount of 4.8. In nearby normal epithelium of esophagus, the P53 protein expression was low with a digitalized value of 0.42. Significant negative correlation between 1433σ and p53 expressions was revealed by Spearman rank correlation analysis (P<0.05). CONCLUSION: The aberrant expression pattern of 1433σ and p53 may contribute to the formation and progression of ESCC and may predict the prognosis of ESCC patients. Proteins 1433σ and P53 have the potential to become biomarkers for early diagnosis of esophageal cancer and endpoint molecules of ESCC prevention.

　　【Keywords】 esophageal neoplasms;  carcinoma, squamous cell; 1433σ; genes, p53;  biomarkers

　　0引言

　　食管癌是我国常见的四大恶性肿瘤之一［1］. 由于目前缺乏特异、敏感的食管癌早期诊断的分子指标，临床上首次就诊的食管癌患者大多数已发展到中晚期阶段，因此鉴定食管癌早期阶段异常的分子改变具有非常重要的意义［2］. 1433σ是一新的候选肿瘤抑制基因，野生型P53可诱导1433σ表达上调［3］. 1433σ蛋白的失表达发生于人类多种肿瘤［4］. 我们运用免疫组化技术检测了1433σ和P53在不同分化程度的鳞癌和相应癌旁正常食管黏膜上皮、各级癌前病变中的表达特征，为探索食管癌发生发展的分子机制及食管癌早期诊断的分子指标奠定基础.

　　1对象和方法

　　1.1对象

　　收集河南省食管癌高发区食管癌手术标本60（男31，女28）例，年龄46～70（58.2±6.8）岁；同时收集相应的癌旁食管上皮标本. 患者术前均未接受任何化疗或放疗. 所有标本离体后立即用40 mL/L甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋，连续切片，切片厚5 μm. 病理学诊断全部为食管鳞状细胞癌(ESCC)，其中，高分化22例，中分化26例，低分化12例. 癌旁食管黏膜上皮包括正常食管黏膜上皮组织44个，基底细胞过度增生病灶38个，不典型增生病灶53个，原位癌22个. 多克隆羊抗人1433σ抗体（Santa Cruz公司）；兔抗羊二抗、ABC试剂盒、DAB底物试剂盒（北京中山生物技术有限公司）.

　　1.2方法

　　免疫组化采用ABC法. 石蜡切片脱蜡，梯度乙醇至水，PBS洗3次，柠檬酸盐抗原修复液（pH 6.0）微波处理30 min后用3 mL/L H2O2灭活内源性过氧化物酶，用1∶50的正常马血清室温孵育20 min，加20 mL/L BSA稀释至1∶200的1433σ一抗和1∶500的p53一抗置于湿盒内，4℃冰箱孵育过夜(12 h). 分别加2%BSA稀释至1∶200的生物素标记的抗山羊和抗鼠二抗，孵育45 min，ABC（1∶1∶50）室温孵育1h，二氨基联苯胺(DAB)和H2O2孵育，显微镜下观察，适时终止反应，最后苏木素复染15～30 s和封片. 阳性对照采用已知阳性切片，以PBS代替一抗做为阴性对照. 免疫组化染色结果评分标准如下. 染色强度评分：无染色为0分；细胞核、细胞膜或胞质呈现淡黄色颗粒，明显高于背景为1分；呈现浅棕黄色颗粒为2分；出现大量色深棕黄色颗粒为3分. 然后根据阳性细胞百分数进行评分：每片随机观察5个视野，计数100个细胞中染色阳性细胞数，阳性细胞数<5%为0分；阳性细胞数5%～25%为1分；26%～75%为2分；＞75%为3分. 染色强度评分与阳性细胞数比例的评分相乘所得之积为最终总评分（0～9分）.

　统计学处理：采用SPSS 10.0统计软件包处理，独立样本t检验用于各组间差异的分析，运用Spearman等级相关分析处理1433σ和p53之间的相关性分析，检验水准取α=0.05.

　　2结果

　　2.11433σ在鳞癌及癌旁不同组织类型中的表达

　　1433σ阳性免疫反应复合物呈淡黄色至深浅不同的棕黄色颗粒，主要分布于细胞膜和细胞质，有时亦可见于细胞核（图1）. 癌旁形态学正常的食管黏膜上皮组织中免疫染色呈深棕黄色，80%以上组织中的阳性细胞百分数大于75%， 1433σ蛋白在癌旁正常上皮表达量的均值为8.22（表1）. 在癌旁食管黏膜上皮发生不同程度的病变时免疫反应的染色强度和阳性反应的细胞数均较正常上皮降低. 随着病变程度加重，1433σ蛋白表达进行性下降，尤其是原位癌时，阳性反应主要呈浅淡黄色，大部分的免疫阳性反应的病灶内阳性细胞百分比在5%～25%，CIS时免疫染色总评分的均值为2.78. 在不同分化程度的鳞癌，1433σ蛋白的表达亦不同. 在高分化鳞癌，1433σ的免疫阳性反应以中强度为主，免疫染色总评分的均值为5.69. 在低分化鳞癌，1433σ蛋白的表达降至最低点，约64%的低分化鳞癌失去1433σ蛋白表达. 统计学分析表明：正常食管黏膜上皮与各级病变、BCH与较重各级病变之间均有显著性差异（P<0.01）；不同分化程度的鳞癌之间，1433σ蛋白表达亦有显著的统计学差义（P<0.01）. 随病变进行性发展，从正常食管上皮至各级病变中1433σ蛋白表达逐渐下降，在低分化鳞癌时表达量最低，免疫染色评分的均值为0.45（图2）.表1食管鳞癌和癌旁正常上皮、各级癌前病变中1433σ免疫反应情况（略）

　　2.2p53在鳞癌及癌旁不同组织类型中的表达

　　仪表P53主要表达于细胞核，免疫反应依强弱不等呈不同程度的棕黄色颗粒（图3）. 在癌旁正常的上皮组织，P53免疫反应阳性细胞主要为散在分布，呈镶嵌型；P53阳性反应率约为25%，免疫染色评分均值为0.42（表2）. 在基底细胞过度增生、不典型增生和原位癌癌前病变时，P53蛋白表达逐渐增强，并且与正常上皮表达比较，有显著的统计学差异（P<0.01）. 在鳞癌中P53蛋白明显高表达，并且表达P53蛋白的细胞多呈弥漫性分布，染色强度亦是强阳性. 在正常食管黏膜上皮和各级病变中，P53蛋白与病变明显相关，随病变进行性发展，P53蛋白表达逐渐增强，在低分化鳞癌中表达量最高，免疫染色评分的均值达到4.86（图2）.

　　2.31433σ和P53相关性分析

　　1433σ蛋白表达模式与P53蛋白表达模式明显不同，1433σ表达高时，p53表达低，反之亦然. 经Spearman等级相关分析，1433σ与P53蛋白表达显著负相关(r= -0.226, P<0.05).图3P53在正常食管黏膜上皮(A)，不典型增生(B)，高分化鳞癌(C)，中分化鳞癌(D)，低分化鳞癌(E)中的表达ABC ×100

　　3讨论

　　我们首次报道了1433σ蛋白在食管鳞癌和癌旁正常食管黏膜上皮、各级癌前病中的表达，发现1433σ蛋白在正常上皮中大量表达，1433σ蛋白表达随病变进展进行性下降，64%低分化鳞癌完全失去1433σ蛋白表达；提示1433σ可能参与了食管鳞癌多阶段的演变过程，并可能与病变严重程度相关；1433σ蛋白可能成为食管癌早期诊断和高危人群监测的分子标志. 此外，在不同分化程度的鳞癌中，14表2食管鳞癌和癌旁正常上皮、各级癌前病变中p53免疫反应情况（略）

　　33σ蛋白的差异表达具有显著的统计学意义，提示1433σ蛋白的缺失可能与肿瘤细胞的侵袭性、转移能力相关. 1433σ又称为HME1或stratifin，是一新的候选抑癌基因［3］，其主要生理功能是参与细胞周期调控、凋亡、有丝分裂信号传导等. 细胞DNA受到损伤时，高表达的1433σ可阻止cdc2cyclinB1进入细胞核启动有丝分裂，为细胞完成修复DNA损伤提供可能［5］. 1433σ基因功能缺陷细胞的基因组的不稳定性增高. 研究发现1433σ的低表达与人类多种肿瘤形成与发展相关，如乳腺［6］、膀胱［7］、前列腺［8］、肝［9］、肺［10］等. 在食管多阶段癌变进程中，1433σ的表达进行性下降，提示低表达或不表达1433σ细胞的修复机制可能受损，增加了病变细胞进一步蓄积突变DNA分子的可能.

　　细胞周期G1期阻滞部分是由p53激活p21/WAF1蛋白表达而介导；G2期的阻滞是由p53激活1433σ基因的表达而实现的［5］. 1433σ基因转录起始点上游1.8 kb处含有p53反应元件［5］. γ射线可诱导含有野生型p53结肠癌细胞系中1433σ蛋白表达增加，而p53基因突变结肠癌细胞系中没有检测到1433σ蛋白表达的变化. 我们检测P53蛋白在食管癌变中的表达，发现正常上皮内P53蛋白少量表达，随着食管上皮细胞病变加重P53蛋白表达增加，低分化鳞癌中表达量最高. P53蛋白有野生型和突变型，免疫组化检测到的P53蛋白主要是突变型，与野生型的抑癌功能不同，突变型P53蛋白能够促进细胞的增殖，加速了癌变进程. 我们发现1433σ和P53蛋白表达具有显著的负相关（P<0.05）. 突变型P53蛋白可能通过结合1433σ基因转录调控区p53反应元件，导致了1433σ基因失活和1433σ蛋白的低表达.

【参考文献】  　　［1］Yang CS. Research on esophageal cancer in China: a review ［J］. Cancer Res, 1980,40:2633-2644.

　　［2］王国清. 食管癌高发现场早诊早治30年临床研究研究经验［J］. 中国医学科学院学报，2001，23：69-72.

　　［3］Leffers H, Madsen P, Rasmussen HH, et al. Molecular cloning and expression of the transformed sensitive epithelial marker stratifin. A member of a protein family that has been involved in the protein kinase C signaling pathway ［J］. J Mol Biol, 1993, 231: 982-998.

　　［4］Hermeking H. The 1433 cancer connection ［J］. Nat Rev Cancer, 2003,3:931-943.

　　［5］Hermeking H, Lengauer C, Polyak K, et al. 1433σ is a p53regulated inhibitor of G2/M progression ［J］. Mol Cell, 1997, 1: 3-11.

　　［6］Simpson PT, Gale T, ReisFilho JS, et al. Distribution and significance of 1433σ, a novel myoepithelial marker, in normal, benign, and malignant breast tissue ［J］. J Pathol, 2004, 202: 274-285.

　［7］Moreira JM, Gromov P, Celis JE, et al. Expression of the tumor suppressor protein 1433σ is down regulated in invasive transitional cell carcinoma of the urinary bladder undergoing epithelial mesenchymal transition ［J］. Mol Cell Proteomics, 2004, 3: 410-419.

　　［8］Cheng L, Pan CX, Zhang JT, et al. Loss of 1433σ in prostate cancer and its precursors ［J］. Clin Cancer Res, 2004, 10: 3064-3068.

　　［9］Iwata N, Yamamoto H, Sasaki S, et al. Frequent hypermethylation of CpG islands and loss of expression of the 1433σ gene in human hepatocelluar carcinoma ［J］. Oncogene, 2000, 19: 5298-5302.

　　［10］Osada H, Tatematsu Y, Yatabe Y, et al. Frequent and histological typespecific inactivation of 1433σ in human lung cancers［J］. Oncogene, 2002, 21: 2418-2424.

基金项目：国家自然科学基金（30700366）