自体骨髓间充质干细胞心肌移植治疗急性心肌梗死的实验研究

作者:马依彤,马翔,张健发

作者单位：新疆医科大学第一附属医院1心脏中心，2血液科，新疆乌鲁木齐830054            【摘要】  目的：观察骨髓间充质干细胞(BMSC) 植入猪急性心肌梗死(AMI) 区的转归及治疗作用。方法：选择10只体重35～45 kg的家猪，经导管应用球囊封堵前降支动脉，建立心肌梗死模型，将存活的9只动物随机分为2组：(1)实验组5只,取骨髓分离BMSC体外培养扩增，建立模型2周后，通过心肌注射的方法将自体骨髓BMSC 移植至AMI 区；(2)对照组4只动物注射等量生理盐水。4 周后比较2组的生存率、心功能变化、心肌功能性蛋白质表达的差异。结果：BMSC移植后，实验组动物心功能得到明显改善，梗死区室壁运动速度加快，局部室壁厚度加快，心肌移植细胞部位表达连接蛋白GATA4等心肌功能性蛋白质。结论：骨髓BMSC 经冠脉转运在心肌微环境下可向心肌细胞分化，并能改善心功能。

    【关键词】  骨髓间充质干细胞； 移植； 急性心肌梗死

　　Experiment of autologus bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for pigs with acute myocardial infarction

　　MA Yitong,  MA Xiang,  ZHANG Jianfa, et al

　　(Department of Cardiology, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University,Urumqi 830054, China)

　　Abstract: Objective: To study the therapeutic effect and differentiation of bone marrow mesenchymal cell (MSC) after transplantaion for pigs with acute myocardial infarction(AMI). Methods: Ten pigs, weight 35～45 kg were used. The acute myocardial infarction (AMI) model was set up by occlution anterior descending coronary artery with balloon. Then the animals were divided into two groups randomly. In the therapeutic group, 80 ml marrow were aspirated and MSCs were islolated and cultured in vitro then were transplantated into AMI area. While 0.9% sodium chloride were injected in the same way in control group. The implantated cells and cardiac special proteins of GATA4  were examined by cellular immunochemical stain at 4 weeks. Echocardiography was performed to observe the changes of cardiac function before and after trassplantation. Results: Four weeks after cell transplantation, the beneficial effects on cardiac function were obvious. The hearts with transplanted cell had better LV ejection fraction and infarction wall movement velocity than those of  control hearts. All the hearts of MSCs transplanted pigs were found that new generated myocardiocytes existed aroud ischemic and infracted zone. Conclusion: Self transplantation of MSCs induced new generated cardiac cells in hearts of acute myocardial infarction pigs and therapeutic effectiveness in improving cardiac function.

　　Key words: mesenchymal stem cells; implantation; myocardial infaction

　　近年来，通过介入治疗和搭桥手术的血运重建术使心肌梗死患者的生存率有所提高，但是大量功能心肌细胞丧失引起的心力衰竭，以及随后发生的纤维化仍是影响远期预后的主要问题，现有的内外科治疗手段并不能很好地解决功能心肌细胞丧失后心脏纤维化的问题。细胞移植进行心肌和血管再生治疗心肌梗死已经成为目前的研究热点［1,2］。本研究通过心肌注射的方法将骨髓间充质干细胞（BMSC）植入猪心肌梗死区及其周边，了解移植后生存率、心功能变化及心肌功能性蛋白质的表达情况，旨在观察对心肌梗死的移植效果和移植细胞的转归。

　　1资料与方法

　　1.1动物心肌梗死模型的建立

　　选择10只成年雌性家猪，体重35～45 kg。麻醉诱导使用阿托品0.05 mg/kg、氯胺酮10 mg/kg肌注。麻醉起效后，建立机械通气，使用戊巴比妥钠30 mg/kg静脉麻醉，同时术中气道给氧2～3 L/min。穿刺左侧股动脉，建立有创血压监测，监测心率、呼吸频率、血氧饱和度，每15分钟记录1次。在X线导引下，将2.5 mm×20 mm球囊（Marverik）送至左冠脉前降支第二对角支远端，以2～3 atm扩张，行冠脉造影，明确完全封堵后持续60 min。以心脏二维超声检查证实局部心肌运动明显减弱或消失、心电图示相应导联出现病理性Q波为心肌梗死模型建立成功。将存活的9只动物模型随机分为实验组(n=5)和对照组(n=4)。在心肌梗死模型建立前、建立后行99mTc MIBI门控心肌灌注显像检测心肌灌注。

　　1.2骨髓间充质干细胞的制备

　　心肌梗死模型建立前1 h，心电监护，动物取俯卧位。在无菌条件下，使用常规骨穿针，在双侧髂后上棘穿刺，抽取80 ml骨髓血。用含肝素生理盐水洗涤3次，通过50 μm的滤网去除大的颗粒；抽取适量 Ficoll (Sigma公司)，将洗涤过的骨髓与肝素生理盐水混匀，再缓缓加入 Ficoll上层，1 500 r/min离心15 min；弃上清，抽取中层液体至离心管中，加入含肝素生理盐水 10 ml，混匀，2 000 r/min离心5 min，弃上清，重复 2 次；沉淀后加入含 20%胎牛血清(Gibco)的IMDM(Sigma)完全培养液10 ml，吹打均匀，加入培养瓶（Coring）中，37℃ 5% CO2孵育箱培养；24 h后换液；待细胞密度达60%～70%时进行传代培养；移植前收集细胞，漂洗3次除去细胞培养液中的胎牛血清，悬浮于1 ml DMEM培养液中用于移植。

　　1.3骨髓间充质干细胞的移植

　　MI模型建立2周后行干细胞移植。实验组动物麻醉后，经左侧第5肋间开胸。分离皮肤、皮下组织及肌肉，打开胸腔，暴露心脏，分离心包，完全暴露左室。使用1 ml注射器、27G针头，在梗死区中央及梗死边缘区注射骨髓间充质干细胞［(1.25～7.54)×106］。每只动物注射点为5个，共注射细胞悬液1 ml，注射后旋转针尖，留针数秒钟，以防止细胞外渗。对照组以同样方法移植，注入相同量的生理盐水。

　　1.4心脏超声检查

　　所有动物在心肌梗死模型建立前及移植后1 h、1周、2周，行心脏超声心动图检查（VIVID7彩色多普勒超声诊断仪），测量左室梗死区室壁厚度（IWT）、收缩期梗死区室壁运动速度（IWMVs），计算左室射血分数（LVEF）。

　1.5病理学观察

　　心肌梗死后2周处死动物，迅速切取小块梗死区、非梗死区、交界区、右室组织，以 4%中性福尔马林固定，制备4 μm厚石蜡切片，行HE染色后观察心肌细胞病理变化。

　　1.6免疫组化检测

　　切片脱蜡、水化，加入1∶10 GATA4抗体，置湿盒，4℃过夜， PBS冲洗， 加入 Dako Envision 37℃孵育 60 min，再加用Cy3(红色荧光)标记的二抗, 在荧光显微镜下进行观察。

　　1.7统计学处理

　　应用SPSS 11.0软件包进行统计学分析，所有计量资料以均数±标准差（±s）表示，计量资料采用t检验，计数资料采用卡方检验，检验水准α＝0.05。

　　2结果

　　2.1手术结果在建立心肌梗死模型过程中有1只动物发生顽固性室颤死亡,9只动物成功建立心肌梗死模型并成功移植BMCS。心电图证实其中6例为前间壁心梗，3只为广泛前壁心梗，均出现急性心肌梗死典型图形变化。2组术后心肌核素显像示左室心尖部及近室间隔部灌注缺损（图1、2）。

　　2.2猪BMSC的体外培养刚接种的BMSC悬液中细胞呈圆形，大小不一，不能辨认细胞核；24 h 后部分细胞开始贴壁，呈椭圆形；第3天，可见散在分布的贴壁细胞，呈细而小长梭形或多边形，第7天以集落样生长方式增殖（图3）;培养至第14天达80%汇合时消化传代，将这些细胞再传代培养，平均每 4～5天细胞达70%～80%汇合。使用流式细胞仪对以上细胞进行表面标志鉴定，细胞表面抗原 CD106 弱阳性，CD90 强阳性。

　　2.3心功能改变实验组移植后与移植前比较, IWMVs增加，IWT及LVEF增高(P＜0.05)。 对照组移植后与移植前比较，IWMVs减小，心肌梗死局部室壁变薄，EF 减低(P＜0.05)。2组动物移植前IWMVs、IWT及LVEF无明显差异；移植后实验组IWMVs高于对照组，IWT较对照组增加，EF改善。由此可见骨髓间充质干细胞移植可以改善局部与整体心功能(表1)。表12组间心功能指标的比较（略）注：与移植前比较, *P＜0.05; 与对照组移植后比较, △P＜0.05

　　2.4组织学检查结果大体标本可见心尖部梗死区室壁明显变薄。实验组梗死区可见大量岛状肌肉组织，对照组则多见均匀一致的疤痕组织；荧光免疫组化染色发现，实验组梗死区可见Cy3(红色荧光)表达的GATA4阳性细胞(图4)，提示移植的细胞在受损的心肌组织中得以存活并分化为心肌样细胞。

　　3讨论

　　冠心病已经成为危害人类健康的主要疾病之一，约占所有心血管疾病死亡率的50％［1］。心肌梗死所至心室心肌细胞大量丢失后室壁收缩力降低、牵拉变薄导致左室扩张,心脏的扩大最终引发心力衰竭。目前，许多治疗手段的目的就是有效限制左室重塑的进程，但是不能解决有效心肌细胞数目减少这一根本性问题。关于细胞移植治疗心肌梗死机制的研究较少，目前多数学者认为，细胞移植可取代坏死心肌细胞，改善MI区弹性，刺激血管新生，限制梗死区变薄，调整存活心肌细胞对梗死区的反应，防止左室扩大及进展性心衰［2,3］。　　本研究采用干细胞治疗MI是期望能够将自身的具有向心肌细胞分化的干细胞植入损伤区，来加强心肌的弹性,防止梗死区变薄,维持左室腔大小及舒缩功能。本研究发现，与对照组相比移植后2周实验组动物，心肌梗死局部室壁厚度增加，提示左室重构得到了显著改善。移植后实验组动物左室梗死区室壁运动速度加快，而对照组则左室梗死区室壁运动速度减小，心肌梗死局部室壁变薄，EF减低。由此可见,骨髓间充质干细胞移植可以改善心肌梗死后局部与整体心功能，这与国外报道是一致的［2~4］。而Tomita等［5］分别将未诱导的及5aza诱导的骨髓细胞注射入冷冻损伤的大鼠心肌疤痕中，发现仅诱导的骨髓细胞组大鼠心功能得到改善，本研究结果与其存在差异，其可能原因是建立模型的方式不同，移植的时机不同，其模型为冷冻损伤。曹丰等［6］提出移植时机对于治疗效果具有重要意义，心肌梗死后炎症反应强烈，不利于移植细胞的存活，而在炎症减弱的瘢痕修复早期尽早进行BMSC移植,可能对于细胞的存活及心功能的恢复较为有利。本研究选择的移植时机为建立心肌梗死模型后2周，符合心肌炎症修复的规律，可能是移植疗效较佳的原因。但Li等［7］报道大动物心肌梗死后的炎症反应持续时间更长，因此最佳的细胞移植治疗时机有待于进一步验证。

　　本研究表明，免疫荧光染色检测可见移植细胞在心肌组织中表达，主要分布在注射的梗死周边区心外膜下，并存在向损伤区迁移特点，但是向周围未损伤区迁移的阳性细胞较少，提示损伤心肌微环境可以提供一个高于正常的心肌特异性生长因子及分化分子条件，并对于BMSC的迁移、分化具有促进作用，这与Orlic等［8］报道BMSC具有在不同组织表达组织特异性基因的功能也是一致的。近来有研究表明，骨髓基质细胞在宿主环境中存在细胞融合的现象［9，10］。由于条件限制，我们未对移植后的细胞进行分选及染色体核型分析，观察是否存在细胞融合现象。

【参考文献】  　　［1］Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R, et al. Transendocardial autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure ［J］. Circulation, 2003,107:22942302.

　　［2］Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium ［J］. Nature, 2001,410：701705.

　　［3］Terada N, Hamazaki T, Oka M, et al. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion［J］. Nature, 2002, 418:542545.

　　［4］Jiang YH, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow ［J］. Nature, 2002,416:4149.

　　［5］Tomita S,Mickle DA,Weisel RD,et al.Improved heart function with myogenesis and angiogenesis after autologous porcine bone marrow stromal cell transplantation ［J］. J Thorac Cardiovasc Surg, 2002,123:11321140.

　　［6］曹丰, 牛丽丽, 张鹏, 等. 骨髓间充质干细胞移植修复慢性梗死心肌［J］. 中国临床康复, 2004,8:50085010.

　　［7］Li RK, Mickle DA, Weisel RD, et al. Optimal time for cardiomyocyte transplantation to maximize myocardial function after left ventricular injury ［J］. Ann Thorac Surg, 2001,72:19571963.

　［8］Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival［J］. Proc Nat Acad Sci USA, 2001,98:1034410349.

　　［9］Fedak PW, Verma S, Weisel RD, et al. Angiogenesis: Protein, gene, or cell therapy ［J］. Heart Surg Furum, 2003,4:301304.

　　［10］Wang J, Shum TD, Galipeau J, et al. Marrow stromal cells for cellu2 lar cardiomyoplasty: Feasibility and potential clinical advantages［J］. J Thorac Cardiovasc Surg, 2000,120:9991006.