亚硒酸钠联合高压氧对创伤性颅脑损伤大鼠模型治疗作用的机制研究

创伤性颅脑损伤(TBI)并发症、合并症多,伤残率、病死率高的突出特征[l],其原发性的损伤、通常导致不可逆转的大脑组织损害,继发性损伤可导致脑缺血,功能衰竭,炎症,氧化应激,神经元死亡[2]。因此,预防和治疗继发性脑损伤脑外伤是TBI治疗的一个主要方面[3]。作者前期的研究结果表明,高压氧联合硒制剂亚硒酸钠治疗大鼠TBI疗效显著,可以显著降低TBI大鼠的脑含水量,减少神经细胞凋亡,改善TBI大鼠的病理情况,且效果优于单用其中的任何一种[1]。但是对其具体的作用机制还不清楚,但是有研究表明,硒元素和高压氧可以抑制氧化应激反应,而作者前期的结果也表明亚硒酸钠联合高压氧可以显著抑制细胞凋亡,作者认为亚硒酸钠联合高压氧可能是通过硒元素与高压氧的共同作用抑制TBI后的氧化应激反应以及抑制凋亡基因的表达而产生保护作用的,本次实验即对此假说进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 亚硒酸钠购于合肥博美生物科技有限公司caspase-3免疫组化试剂盒购于北京北方伟业生物公司,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG,以及caspasc-3一抗均购于Santa Cruz公司;TRIZ○L购于Sigma Aldrich公司。白质定量试剂盒、二抗工作液、DAB显色液、RIPA裂解液以及DEPC水均购自碧云天生物技术研究所;phmcr mix购于日本TOYOBC)公司;MDA检测试剂盒、GSH检测试剂盒、GsH检测试剂盒等均购于南京建成生物工程研究所,GAPDH、bc1-2和caspase-3基因的引物均由上海鼎国生物合成。其他化学试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验动物健康成年雄性SD大鼠30只,体质量280~320g,由第三军医大学大坪医院动物中心提供,SPF级。生产许可证号:SCXK(渝)2007-0005。喂养标准饲料喂养和饮用纯净水,使用动物专用洁净垫料,恒温20~25℃。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型的建立及处理 将SD大鼠随机分为3组,分别为正常组、模型组(脑损伤组)和联合组(用亚硒酸钠联合高压氧干预组),每组10只。模型组仅建立颅脑创伤模型,采用改良Feeney法制作颅脑创伤模型[1],将实验大鼠提前3d单独喂养,术前禁食12h,不禁水,称体质量。选取俯卧位将实研大鼠固定于打击平面上。按照文献报道的不开颅骨致中度脑损伤的方法,用前端直径37.5px、末端直径3Ocm的100g祛码于1m高处坠落,以前端为打击面准确将落击点定位于大鼠头部双耳前缘与眼后缘的正中连线上,造成中度的闭合性颅脑损伤。撞击后,大鼠出现短暂的四肢抽搐、呼吸暂停数秒,或者鼻腔出血、小便失禁等各种症状表现。打击致伤后0.5、10 h分别进行神经功能缺损评分(NSS),筛选处于中度损伤评分范围的大鼠。正常组不做任何处理。创伤模型制成后将大鼠放回笼中,给予正常饮食。用亚硒酸钠联合高压氧干预组大鼠在造模前1个月将亚硒酸钠按0.8mmo1/L的浓度添加入饮用水中进行喂食,另外,在建模后1、24、48h的时候进行高压氧治疗:人舱后5min加压至0.02MPa(12ATA),同时纯氧洗舱,之后加压5min至0.1Mpa(2ATA)。稳压吸氧40min,减压10min,舱内氧浓度保持在95%以上,直至建立模型后72h。

1.3.2 动物组织的处理 各组大鼠在使用各自的实验方案治疗72h后,各鼠断头处死,取出脑,一部分按100mg组织0.5 mL液体的比例使用RIPA裂解液匀浆,用于检测MDA、SOD及GSH含量;一部分按100mg组织0.5mL液体的比例用Trizol匀浆,提取总RNA;另取皮质及海马CA1区组织进行免疫组化实验。

1.3.3 指标检测 使用RIPA裂解液匀浆后,使用BCA试剂盒进行蛋白定量,再按照MDA、SOD以及GSH的说明书进行含量的测定。使用Trizo1匀浆组织提取总RNA、经异丙醇沉淀及乙醇洗脱后,在微量分光光度计定量,A260/A260在2左右可以作为实验样品使用。使用DEPC水溶解,到BI○RADPCR仪进行逆转录反应,收集逆转录得到cDNA,在罗氏的real-time PCR仪进行实时荧光定量PCR反应。各种基因的引物分别为:GAPDH,sense:ACC ACA GTC CAT GCCΛTC AC,antisense:TCC ACC ACC CTG PTG CTGTA;bd2,sensc:CTG GTG GAC AAC ATC GCT CTG,antisense:GGT CTG CTG ACC TCA CTT GTG;caspas-3,sense:GCA CTG GAATGT CAG CTC GCA A,antisense:GCC ACC TTC CGGTTA ACA CGA G。各种基因的相对表达量为bcl-2以及caspase-3分别与GAPDH表达量相比得出的相对值。

免疫组化检测caspase-3蛋白水平的表达:切片常规脱蜡至水,0.01mmo1/L PBS清洗3次,每次5min,3%甲醇一过氧化氢溶液室温下孵育20mh,蒸馏水清洗3次,每次5min,0,1mmol/L枸橼酸缓冲液微波炉内热修复,98C维持30min,冷却至室温,10%山羊血清,37C温箱湿盒内孵育30min,滤纸吸去多余血清,加一抗(兔抗1:l00)湿盒过夜,0.01mmol/L PBS清洗3次,每次5min,滴加生物素化二抗(山羊抗兔)工作液,37·C温箱湿盒内孵育30min,0,01mmol/L PBs清洗3次,每次5min,滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液,37C温箱湿盒内孵育30min,0.O1M PBS清洗3次,每次5 min,DAB显色2~5min,自来水充分冲洗,终止显色,梯度乙醇脱水:70%,80%,90%乙醇各5min,95%乙醇10min,100%乙醇I、Ⅱ各15min,二甲苯I、Ⅱ、Ⅲ各15min透明,中性树胶封片固定。阴性对照:用0.01mmol/L PBS替代一抗,其余步骤同上结果判定:以caspase-3蛋白的阳性表达定位于神经细胞的胞核及细胞质,呈棕黄色。采用○lympus倒置光学显微镜对caspase-3蛋白的阳性表达细胞进行观察。

2 结果

2.1  MDA、SOD以及GSH含量 模型组的MDA含量与正常组相比显著升高(P<0.05),雨SOD和GSH的含量则显著降低(P<0.05),在联合应用高压氧和亚硒酸钠治疗以后MDA含量显著降低(P<0.05),s○D和GSH的含量则显著升高(P<0.05),见表1。

2.2  blc1-2和caspase-3 mRNA的表达bcl-2的在模型组的表达与正常组相比显著减少(P<0.05),联合组大鼠的表达与模型组相比则显著增加(P<0.05);于正常组相比,模型组大鼠caspase-3 mRNΛ的表达显著增加(P<0.05),而与模型组相比联合组则显著降低了caspase-3 mRNA的表达(P<O.O5),见图1。

2.3 caspase-3蛋白的表达结果 caspase-3蛋白的阳性表达定位于神经细胞的胞核及细胞质,呈棕黄色。正常组仅见到极少数的caspase-3阳性细胞。而在模型组,无论是在大脑皮质区域,还是在海马组织都出现了大量caspase-3阳性细胞。联合治疗组在上述两个观察区域的阳性细胞数表达则明显减少

3 讨论

氧化应激是许多疾病如糖尿病、TBI后常见的反应[5],作者研究表明,在TBI大鼠脑内sOD、GSH的含量显著降低,MDA含量显著升高,而联合治疗组则可以增加S(DD、GSH的含量,降低MDA含量,表明其作用机制之一就是清除氧自由基,增加自由基清除剂的产生。

细胞凋亡是指细胞程序性的死亡[6],在脑损伤后在引起脑细胞坏死的基础上,也同时伴有细胞凋亡因子的大量表达,而过度的凋亡必然损伤受伤个体脑神经的活动[7]。Bcl-2基因是在研究淋巴瘤时发现的,它作为一种生存基因,对细胞凋亡具有重要的调节作用[8]。有研究发现,bc1-2基因在TBI的症状早期就能够观察到,而且随着TBI的发生,细胞凋亡性死亡逐渐增多,其表达会进一步下降。过量表达Bcl-2蛋白的转基因小鼠产生TBI以后,其大脑皮层损伤程度以及其他部分神经功能的损伤都明显减弱[9]。caspasc3在细胞凋亡中起着不可替代的作用,是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶,可切断DNA修复蛋白和细胞骨架蛋白等,从而使DNA断裂,引起细胞凋亡[10]。TBI后caspase-3等细胞凋亡表达增强,活性水平也相应地增加。作者的实验结果也显示TBI后bc1-2 mRNA表达显著降低,caspase-3的mRNA表达和受体的组织分布显著增加,诱导了细胞的凋亡,而联合应用高压氧和亚硒酸钠则可以显著升高bl。12的表达,降低caspase3的表达,减少了脑细胞的凋亡,从而减少了脑损伤。硒元素是一种具有抗氧化作用的非金属元素,在作者前期的研究中已经证实TBI前单独使用亚硒酸钠也会产生对TBI大鼠的保护作用,但是和高压氧一样,二者的单独应用效果均低于亚硒酸钠联合高压氧。

TBI属于一种急性的损伤,本次研究中的前期给予亚硒酸钠的方法在临床上是不可行的。由于作者的研究是首次探讨硒元素在TBI中的保护作用,所以作者需要的是体内的硒元素达到一定的治疗浓度,而亚硒酸钠单次少量口服不会使血液的硒浓度大量升高,而大量口服亚硒酸钠会产生一定的毒副作用,因此作者通过在饮食中加人低剂量的亚硒酸钠,以使血液硒的水平达到合适的浓度,作者希望出现合适的硒制剂联合高压氧来治疗TBI。综上所述,在已经证实高压氧和亚硒酸钠联合应用治疗TBI疗效显著以后,本次研究的结果进一步表明,高压氧和亚硒酸钠联合应用治疗TBI的作用机制主要有两个方面,一方面是降低氧自由基的生成,增加自由基清除剂SOD和GSH的水平达到减少神经损伤的效应;另一方面,其抑制细胞凋亡的机制是因为其可以显著升高凋亡抑制基因bc12的表达,并降低凋亡基因caspase3的表达,从而抑制神经细胞的凋亡。

参考文献

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