PON的研究进展

　　作者：郭阳 江新梅 作者单位：吉林大学第一医院神经内科，吉林 长春 130021

　　【关键词】 对氧磷酶;有机磷中毒;心脑血管疾病;基因

　　对氧磷酶(PON)是一类能催化水解磷酸酯键的芳香酯酶。它既可降解有机磷酸酯、芳香羧酸酯及氨基甲酸酯等，又可减少过量过氧化物、氧化型磷脂的生成。目前，PON活性改变与有机磷中毒、心脑血管疾病、肾动脉硬化、妊高症、细菌扩散能力及耐药性均有关。其可以提供机体对有机磷杀虫剂的保护作用，而随着有机磷杀虫剂逐步禁用，中毒发生可能已明显减少。但随着人口老龄化，动脉粥样硬化、心脑血管疾病发生率逐步上升。PON具有减少过量过氧化物、氧化型磷脂的生成，降低动脉粥样硬化发生率，减少和减轻心脑血管疾病发生的作用。研究和探讨PON活性改变与动脉粥样硬化、心脑血管疾病、肾动脉硬化的相关性及其应用前景对于多种老年疾病的治疗有着重要意义。本文结合参考文献对PON的研究进展及其在老年疾病方面的应用前景作一综述。

　　1 PON基因家族

　　包含PON1、PON2和PON3三个基因〔1〕，在人类位于染色体7q21.3～7q22.1区，全长约26 kb，含9个外显子和8个内含子。此三个基因位置相邻，分别相距约500 bp，按照着丝点PON1、PON3和PON2端粒的顺序排列，结构高度同源，其表达产物为对应的三种蛋白。

　　1.1 PON1

　　1.1.1 PON1基因表达水平 PON1分子量约43～45 kD,包含三条糖链，由肝脏合成后与高密度脂蛋白结合，广泛分布于肝、肾、肠组织和血清。启动子位于PON1基因上游约1 090 bp内，表达产物为sp1，长度不等。一般认为，其活性与长度无绝对对应关系，但长度700bp以下者活性很低。另外，现已确定了sp1五种多态性,分别是 -107C/T、-126G/C、-162G/A、-831G/A和-908G/C〔2〕。

　　现已发现不同种属生物PON1基因多态性位点近200种,其中,171个位于内含子,5个位于外显子,上下游非翻译区分别含有7个和5个。常见的基因多态性有两种,分别是192位点的CGA/CAA置换导致谷氨酸/精氨酸多态性(Q/R多态性)和ATG/TTG颠换导致55位蛋氨酸/亮氨酸多态性(M/L多态性)〔3〕。Q/R多态性是PON1活性的主要决定因素〔4〕，其同工酶对各种底物的亲和力和水解活性存在差异〔5〕。体外实验显示，Q型PON1抗氧自由基作用出现于反应初期，抗氧化能力强，具有更强的保护低密度脂蛋白(LDL)免受氧化修饰的作用;R型PON1水解对氧磷的能力是Q型的6倍。Q/R型PON1活性不同，2005年末通过对PON1晶体X线衍射分析证实其为单一活性中心。另有学者，在高加索人群发现多种不完整的PON1表达，部分蛋白有活性。

　　人类PON1活性在个体间可相差10～40倍，这种差异与基因多态性有关联〔6〕。研究证实，湖南汉族对照人群中Q/R等位基因分布趋势与华人和日本人群的PON 1Q192R基因型基本一致，明显不同于白种人和印第安人〔7〕，说明Q192R基因频率分布存在种族和个体差异。

　　不同种属生物PON1基因表达水平不同，兔高于大鼠，啮齿类高于人类，鸟类最低。PON1活性在人群中的分布相差非常大,不同个体之间可相差巨大，即使相同基因型也可相差达13倍〔8〕。PON1表达水平由启动子sp1表达水平决定，sp1的多态性及长度不同导致了启动子活性的不同，由此导致PON1基因表达水平的不同。研究发现，白种人-107C/T多态性对人群PON1基因表达水平变异度影响最大，-162G/A多态性影响较小，其他多态性影响很小或不存在独立的影响。汉族人群-107C/T多态性对PON1基因表达水平变异度存在影响。

　　1.1.2 PON1与有机磷中毒 PON1各组织器官都有分布,肝脏和血液酶活性最高，对于血清有机磷类降解起主要作用〔9〕。由于不同种属生物PON1基因表达水平不同，人类和禽类对有机磷类农药敏感而啮齿类动物不敏感。人类个体对有机磷类农药敏感度亦不同，这主要由PON1活性在个体间的不同所造成，包括基因表达水平的不同及基因多态性两方面。欧洲和北美人群PON1活性呈马鞍形分布，国内人群尚未见报道。提取和保存PON1困难，细菌转染质粒表达PON1很少有活性，以腺病毒载体表达PON1动物实验已成功，可能为有机磷中毒治疗提供一种新方法。R型PON1水解对氧磷的能力强，迅速发挥作用，水解对氧磷的保护作用更明显。

　　1.1.3 PON1与动脉粥样硬化(AS) 对氧磷酶1有保护高密度脂蛋白(HDL)避免氧化，调解巨噬细胞吞噬能力，降低AS发生率的作用。PON1与HDL上的血小板活化因子——已酰水解酶(PAFAH)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)〔10〕，载脂蛋白J(apoJ)协同发挥抑制氧化修饰作用，防止氧化产物在LDL的堆积，并可以破坏和减少LDL在氧化过程中产生的具有细胞毒作用的溶血磷脂减少内皮细胞脂质过氧化损伤〔11〕。PON1基因敲除小鼠模型血浆中的HDL和LDL更易于氧化〔12〕，氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)可导致巨噬细胞转化为泡沫细胞，泡沫细胞不断在内皮下积累的结果是发生脂质条纹病变。另外oxLDL还可通过直接损伤内皮细胞，损伤内皮依赖舒张功能和内皮抗凝及纤溶功能，增加内皮黏附等途径促进AS的发生发展。PON1可降低单核细胞对内皮细胞的黏附力和趋化性。统计资料显示，AS进展时，动脉壁PON1浓度和活性显著增加〔13〕，oxLDL水平的升高和PON1活性的下降与脑梗死范围成比例，PON1活性在基底节梗死中最高。认为后循环脑梗GQX 存在更多的血液动力学因素。心血管系统动AS各支冠状动脉变异不大。PON1基因192位多态性是PON1活性的决定因素，其等位基因分别为Q/R。由于PON1可以水解脂质过氧化物,减少LDL的氧化，PON1多态性可影响遏制AS发展和预防炎症的能力〔14〕。但Mackness〔15〕等总结8个实验室报告PON1 192位基因多态性与冠心病关系病例对照，结论不一致：印度R等位基因冠心病患者频率R型(0.45)高于Q型(0.17)。对加拿大HutteriteBrethren部落人群研究显示，PON1基因QQ型者较QR及RR型者血清TG、低密度脂蛋白C及apoB水平均显著降低。中国人正常对照组PON1192位Gln-Arg位点具有QQ基因型者血清apoA 水平较RR型者明显高，而血清apoB水平则显著低于QR及RR型者。统计台湾冠心病病例则无明显相关性。PON1对HDL保护LDL免受氧化修饰具有重要意义，2型糖尿病患者PON1基因311位半胱氨酸/丝氨酸多态性与并发心血管疾病、视网膜病变有相关性，但存在人种差异〔16〕。

　　1.1.4 PON1 与妊高征 其作用机制目前认为与AS有关。孕妇血清中的PON、HDL、LDL以及与之相应的载脂蛋白比非孕妇高，其中血清甘油三酯和PON1水平呈正相关。结合在HDL上的PON1能水解氧化性磷脂和胆固醇过氧化物，抑制LDL氧化，减少oxLDL的生成。由于脂质过氧化导致的慢性血管内皮受损被认为是血管机能障碍和损伤的前体，LDL的氧化是这个病程关键的一步。PON1具有重要的保护作用。重度妊高征患者血清中的PON1活性与正常妊娠相比明显下降，血清中HDL水平与PON1活性呈正相关。妊高征患者体内过氧化底物增加，LDL和HDL白颗粒易被化学修饰成oxLDL和oxHDL。妊高征先兆子痫患者血浆中甘油三酯和游离脂肪酸水平相当于正常妊娠的两倍，并伴有LDL颗粒增多。这些颗粒损伤血管内皮细胞，使其通透性增加，刺激单核细胞进入血管壁，形成巨噬细胞并泡沫化，胆固醇沉积，形成粥样斑块。有研究发现一些致炎细胞因子可通过调节肝细胞PON1mRNA的表达影响HDL的抗氧化特性。其中ILβ、TNFα下调PON1mRNA的表达,而IL6起上调作用。先兆子痫患者TNFα分泌增加，而TNFα分泌增加可导致下调PON1mRNA表达的能力增强。

　　1.1.5 PON1与早产 PON1在胎儿血清中的浓度升高，经胎盘作用于胎膜上的甘油磷酸酯，使其分解产生花生四烯酸，并进一步分解产生大量前列腺素，作用于周围肌层弥散，引起子宫收缩，最终造成早产。PON1的基因多态性在早产的发病中起着一定的作用。

　　Chen等研究了早产的和足月产的新生儿及其母亲的PON1192Q/R。新生儿组PON1RR与早产有关，而母亲的PON1基因型与早产无关，而且母亲和新生儿的基因型间无交互作用。提示PON的变异在早产的发病中起着一定的作用。

　　1.1.6 PON1与细菌扩散能力及耐药性 由于PON1可催化分解过氧化物，有调解巨噬细胞吞噬能力，降低巨噬细胞杀菌效率的作用。PON1与细菌扩散能力及耐药性有正相关性。

　　1.2 PON2

　　1.2.1 PON2和PON3基因是通过遗传学的方法发现的。

　　1.2.2 PON2与动脉硬化 实验证实PON2具有与PON1相同的抗氧化特性，保护LDL免于被氧化、逆转轻度氧化LDL氧化进程和抑制轻度氧化LDL诱导的单核细胞趋化性，可在细胞内发挥抗氧化作用〔17〕。PON2在人类巨噬细胞、内皮细胞及动脉平滑肌细胞均有表达〔9〕。统计资料显示，PON2基因多态性同PON1基因多态性一样可影响血脂和血浆脂蛋白水平。PON2基因311位点Cys→Ser等位基因定义为C/S，3种基因型分别为CC型,CS型,SS型。PON2S311位点变异与冠心病有相关性，PON2A148/S311等位基因纯合子血浆总胆固醇、胆固醇和apoB水平显著高于其他2种基因型个体，但临床资料显示只有当PON2S311变异与PON1R192变异同时存在时才与冠心病有相关性。目前认为，PON2基因多态性与大血管病变有关。

　　另外，2型糖尿病合并冠心病组PON2基因311位点多态性以SS型基因占优势〔18〕。

　　1.2.3 PON2与早产 与PON1作用类似，PON2可以经胎盘作用于胎膜上的甘油磷酸酯产生花生四烯酸，并进一步产生大量前列腺素，引起子宫收缩，造成早产。研究表明，新生儿PON2CC同组PON1RR一样与早产有关，而母亲的PON1和PON2基因型均与早产无关，而且母亲和新生儿的基因型间无交互作用。提示PON2基因在胚胎发育期表达的差异在早产的发病中起着一定的作用。

　　1.2.4 PON2与细菌扩散能力及耐药性 因PON2在人类巨噬细胞中表达，在催化分解过氧化物，降低巨噬细胞杀菌效率方面起重要作用。

　　1.3 PON3 PON3是一种内酯酶，最初在兔的高密度脂蛋白中发现，以后在HepG2细胞发现了PON3基因表达。PON3基因是通过遗传学的方法发现的，含有5个外显子和3个内含子，已发现5个突变位点，其中3处为无义突变，导致PON3基因多态性的是311位和324位点分别出现丝氨酸/苏氨酸、甘氨酸/天冬氨酸置换〔4〕。这些位点的多态性对PON3的影响还有待研究。PON3基因表达产物为53个氨基酸，基因产物主要在肝脏表达，少部分在肾脏中合成，只存在于血浆的HDL中。其在人体组织中的表达和生理作用与PON1相似。PON3主要在肝脏合成,少部分在肾脏中合成,也只存在于血浆的HDL中。PON3分布在不同种属动物不完全相同，PON3在小鼠巨噬细胞中表达，但在人的巨噬细胞中只有PON3无表达。

　　实验证实PON3具有与PON1和PON2相同的抗氧化特性，提示其可能影响心血管疾病的遗传易感性。

　　2 PON的研究、应用和展望

　　2.1 PON在有机磷中毒方面应用前景 PON作为一类能催化水解磷酸酯键的芳香酯酶，既可降解有机磷酸酯，又可减少过量过氧化物、氧化型磷脂的生成。其降解有机磷酸酯的作用导致PON对有机磷中毒有保护作用，造成了不同种属、不同个体对有机磷酸酯的敏感性不同。

　　2.2 PON在AS、心脑血管疾病及肾动脉硬化方面应用前景

　　2.2.1 检测PON基因型预测发生AS、心脑血管疾病、肾动脉硬化的危险性 PON降解过量过氧化物有减缓AS的作用，导致其对心脑血管疾病、妊高症、肾动脉硬化的保护作用。目前，随着人口老龄化，AS、心脑血管疾病发生率逐步上升。现在全球死亡病例75%以上与心脑血管疾病有关。因此，研究影响PON活性相关的基因型与AS、心脑血管疾病、肾动脉硬化的相关性在预测发生AS、心脑血管疾病、肾动脉硬化的危险性方面有着重要意义。PON基因型常用的鉴定方法均为PCR扩增PON基因部分片断、酶切、电泳鉴别，有关技术成熟，经积累国内不同民族、不同地区人口统计数据，将具有重要的临床意义。

　　2.2.2 PON在AS、心脑血管疾病及肾动脉硬化生物治疗方面应用前景 实验证实，PON对心脑血管疾病动物模型有保护作用，在AS、心脑血管疾病及肾动脉硬化治疗有效。

　　PON作为一种蛋白质，其活性有赖于正确的空间构相。而目前研究最多的PON1在理论上也可以有多种空间构相，形成其正确的空间构相有赖于细胞内特定的酶反应体系。应用大肠杆菌转染质粒表达PON常无活性。在血清提取PON可以保证活性，但储存困难，且来源极难解决。体外实验和动物实验常应用腺病毒载体或腺病毒相关病毒载体携带有PON基因表达PON。其中，腺病毒载体不与宿主细胞染色体整合，作用常在1 w左右，一般3～4 d表达稳定，是目前较为成熟的表达PON方法。而同源重组法构建的腺病毒可以被批准应用于临床，这为有机磷中毒更有效的临床治疗方法提供实验和理论依据。但由于AS是一个长期的病理过程，需要较长时间提高PON活性，应用腺病毒载体受到限制。同时，过高的PON活性会降低巨噬细胞杀菌效率，造成机体抵抗力的下降，增加老年病人感染的危险，要求载体具有有效、安全的调节PON表达的能力。目前仍限于体外实验和动物实验。

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