MRN复合体基因在头颈肿瘤治疗中的应用概况

　　作者：王代友,综述,周诺,审校　　作者单位：广西医科大学附属口腔医院，广西南宁

　　【关键词】 MRN复合体;DNA双链断裂;放射敏感性

　　MRN复合体是由Mre11、Rad50及Nbs1三个亚单位组成的一种高度保守的蛋白复合体，是最先识别DNA双链断裂并发出信号的反应子。近来研究证实：它在DNA双链断裂(Double Strains Breaks,DSBs)修复过程中，发挥着至关重要的作用[1，2]。

　　1.MRN复合体的基本结构

　　MRN复合体中的3个亚基蛋白含有多个结构域，这确保了它在对DSBs反应中，具备建筑学上的、结构学上的、酶的、感觉的以及信号传导的功能[3]。MRN复合体的形成是通过Mre11内切酶直接作用，将Nbs1、 Rad50及 DNA绑定在一起。Rad50是一种维持染色体结构稳定的相关蛋白，含有ATP绑定盒ATP酶(ATPbinding cassette ATPase)、锌钩(Zn hook)以及卷曲螺旋(coiledcoils)等结构。通过这些结构，桥连DNA两侧断端，易化Mre11对DNA末端的加工。而Nbs1亚基 N末端含有FHA(forkhead associated　domain)结构域和BRCT(Cterminal of a breast cancer susceptibility protein)结构域;其C末端含有ATM激酶(ataxiatelangiectasia mutated kinase)与Mre11交互反应的结构域等。通过这些结构域，在MRN复合体中发挥功能作用。

　　2.MRN复合体的基本功能作用

　　在DSBs修复过程中，MRN复合体至少有3个相互关联的重要作用：①快速识别DSBs并建立蛋白核酸固定框架;②启动DSBs识别和细胞周期检控点信号网络传导，并经ATM激酶建立DSBs外部识别标志;③调节DSBs周围染色质的改建。MRN复合体启用同源重组和非同源末端连接两种方法修复DSBs，这两种不同的修复方式可起到相互协同的作用。在控制人体细胞DSBs修复通路上，正是MRN复合体发挥中心桥梁的作用[3]。一般认为，细胞周期检控点的激活过程是：MRN复合体中的感应元检测到DNA损伤后，立即传导信号给ATM激酶，然后ATM发信号给其下游的效应子，再由效应子来调节细胞周期运转。另外，MRN复合体在DNA复制和端粒长度维持上，也发挥重要作用[4，5]。

　　MRN复合体中的三个亚单位基因突变可引起DSBs的识别和修复功能障碍，从而引起独特的遗传疾病。Nbs1基因突变可引起Nijmegen 断裂综合征(Nijmegen Breakage Syndrome，NBS);Mre11基因突变可引起共济失调毛细血管扩张样疾患(AtaxiaTelangiectasia Like Disorder，ATLD)。这两种遗传疾病表现相似，主要有：基因组的不稳定性、辐射极度敏感性、癌症的易感性以及神经退化病[6～9]等。而NBS和ATLD与ATM基因突变所引起的AT疾病患者也有着相似的临床表现和细胞表型，这些表现包括：细胞染色体不稳定，放射敏感性以及细胞周期检控点缺陷等。因此，认为MRN复合体与ATM在同一个信号通路上发挥对DSB的识别和修复功能作用[10,11]。

　　ATM激酶是另一个重要的细胞DNA损伤修复相关的调节子,它是一种DNA修复激酶。在正常细胞中，ATM以无活性的二聚体或高度有序的多聚体形式存在。面对电离辐射，ATM被激活，二聚体解体，形成单体，并快速地自我磷酸化。在ATM的激活过程中，MRN充当最初的感应元。体外实验证实：MRN可以直接激活ATM，在此过程中，Nbs1充当具有调节功能的适配子。活化的ATM酶磷酸化其下游的，与细胞周期检控点、细胞凋亡反应和DNA修复相关的一系列酶底物，包括：p53,Chk2,BRCA1,RPAp34,H2AX,SMC1,FANCD2,Rad17,Artemis and Nbs1等，并启动细胞周期检控点G1/S、S和G2/M来调控细胞周期，以利于DSB的修复[12]。

　　总之，MRN复合体是DSBs最初发现者和信号传导者，在DSBs修复中起骨架桥梁作用，并在DSBs发生早期募集ATM酶，启动DSBs的修复机制。MRN复合体在DSBs修复过程中的作用和机制，正在引起生物医学界的极大兴趣。

　　3.MRN复合体亚单位基因转染在头颈肿瘤中的应用

　　放疗和化疗均可以引起肿瘤细胞DNA链断裂，其中最严重的是DSBs，如果得不到及时修复，细胞可发生直接死亡或者进入程序性死亡[13]。MRN复合体在细胞DSBs修复过程中有着重要的调节作用。当前利用MRN复合体功能抑制的方法来干扰细胞DSBs修复作用，增加肿瘤细胞放、化疗敏感性，以达到治疗肿瘤的目的，这一治疗恶性肿瘤的设计思路已经开始进入实验研究阶段。目前，已有学者利用突变型Nbs1基因细胞转染破坏MRN复合体功能结构，达到肿瘤治疗目的[7]。其原理是：突变型Nbs1与细胞体内正常Nbs1竞争性结合Mre11，形成无活性的MRN复合体，从而抑制MRN复合体功能。

　　Nijmegen 断裂综合征的患者，由于MRN复合体中的Nbs1基因突变而发病，其中最典型的症状是组织细胞对电离射线的高敏感性。因此，根据这种罕见基因遗传病表现，有研究者提出：破坏肿瘤细胞MRN复合体的功能可以提高细胞的放射敏感性的学说。根据这一假设，O'Malley等人[14]用携带突变型Nbs1 基因的重组腺病毒体外转染人头颈部鳞状上皮细胞癌来源的细胞系，发现转染突变型Nbs1 基因的癌细胞生长明显受到抑制，联合应用放射治疗后可明显增加癌细胞的放疗敏感性，并增强了治疗效果。细胞周期实验表明：大多数癌细胞生长周期阻滞在G2/M 时相。端粒酶活性分析显示：转染突变型Nbs1 基因后，癌细胞端粒酶活性明显下降，联合放疗后细胞端粒酶活性较单纯基因转染治疗效果更加显著。结果提示：突变型Nbs1 基因转染治疗头颈肿瘤细胞，可显著增强放疗效果。Rhee 等人[15]构建全长Nbs1 cDNA序列的腺病毒载体，然后转染人头颈肿瘤细胞株JHU011，得出类似的实验结果。JHU011癌细胞株在转染Nbs1后，细胞放射敏感性明显增加，细胞生长活性大大降低。结果提示：MRN复合体功能结构的破坏可增加细胞放射的敏感性，对MRN复合体功能的干预有望成为肿瘤放射治疗增敏的新靶点。

　　肿瘤细胞DSBs修复能力的提高是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性的一个基本原因[16]。MRN复合体在DNA双链断裂修复过程中发挥着关键性的作用。 Tran等人[17]用突变型Nbs1基因转染人头颈部鳞状细胞癌JHU006 and JHU029两个细胞株。结果体外细胞生长活性检测分析发现突变型AdNbs1基因转染可显著提高顺铂诱导的细胞毒性。中性彗星分析显示：AdNbs1基因转染联合顺铂化疗， 可显著增强细胞DNA双链断裂程度。研究表明：突变型AdNbs1基因转染可显著提高顺铂诱导的DNA双链断裂水平以及细胞毒性，DNA双链断裂破坏的程度与细胞毒性水平一致，提示抑制肿瘤细胞MRN复合体的DSBs修复功能可提高肿瘤化疗敏感性，改变细胞DNA修复能力可为提高化疗敏感性提供一个新的方法。

　　综上所述，MRN复合体在细胞DNA双链断裂修复中发挥着极其重要的作用。正是利用这一功能特性，研究者们试图干扰其DSBs修复功能以达到抑制肿瘤生长的目的，或者联合放疗或化疗，增强其抗肿瘤作用，减少单一放疗或化疗剂量，以降低其副作用。相信随着对MRN复合体研究和认识的不断深入，会有更多高效的MRN复合体功能抑制子被发现(如利用小分子RNA干扰技术抑制MRN复合体三个亚单位Mre11、Rad50及Nbs1基因功能)， 对MRN复合体功能的干预将会在抗肿瘤治疗过程中发挥重要作用。

　　【参考文献】

　　[1]Chen L,Nievera CJ,Lee AY,et al.Cell cycle-dependent complex formation of BRCA1.CtIP.MRN is important for DNA double-strand break repair[J].J Biol Chem，2008,283(12):7713-7720.

　　[2]Williams RS,Williams JS,Tainer JA.Mre11-Rad50-Nbs1 is a keystone complex connecting DNA repair machinery,double-strand break signaling,and the chromatin template[J].Biochem Cell Biol,2007,85(4):509-520.

　　[3]MF Lavin.ATM and the Mre11 complex combine to recognize and signal DNA double-strand breaks[J].Oncogene,2007，26(56):7749-7758.

　　[4]Lee AY,Liu E,Wu X.The Mre11/Rad50/Nbs1 complex plays an important role in the prevention of DNA rereplication in mammalian cells[J]. J Biol Chem,2007,282(44):32243-32255.

　　[5]Zhong ZH,Jiang WQ,Cesare AJ,et al.Disruption of telomere maintenance by depletion of the MRE11/RAD50/NBS1 complex in cells that use alternative lengthening of telomeres[J].J Biol Chem,2007 Oct 5,282(40):29314-29322.

　　[6]Cheung V G, Ewens W J. Heterozygous carriers of Nijmegen Breakage Syndrome have a distinct gene expression phenotype [J].Genome Research, 2006,16(8):973-979.

　　[7]Krueger L, Demuth L, Neitzel H, et al. Cancer incidence in Nijmegen breakage syndrome is modulated by the amount of a variant NBS protein[J].Carcinogenesis, 2007, 28(1):107-111.

　　[8]Lee W T, Chang W H, Huang C H, et al. NBS1, the Nijmegen breakage syndrome gene product, regulates neuronal proliferation and differentiation[J].Journal of Neurochemistry, 2007,102(1):141-152.

　　[9]Taylor A M, Groom A, Byrd P J. Ataxia-telangiectasia-like disorder (ATLD) - its clinical presentation and molecular basis[J].DNA Repair,2004,3(8-9):1219-1225.

　　[10]Wood R D, Mitchel M, Lindahl T. Human DNA repair genes[J]. Muta Res,2005,577(12):275-283.

　　[11]Kasten-Pisula U, Windhorst S Dahm-Daphi J, et al. Radiosensitization of tumour cell lines by the potyphenot Gossypol resutts from depressed double-strand break repair and not from enhanced apoptosis[J].Radiotherapy & Oncology，2007,83(3):296-303.

　　[12]JH Lee and TT Paull. Activation and regulation of ATM kinase activity in response to DNA doublestrand breaks[J].Oncogene 2007,26(56):7741-7748.

　　[13]Roos W P, Kaina, Bernd. DNA damage-induced cell death by apoptosis[J].Trends in Molecular Medicine, 2006,12(9):440-450.

　　[14]O'Malley BW,Li D,Carney J,et al.Molecular disruption of the MRN(95) complex induces radiation sensitivity in head and neck cancer[J].Laryngoscope,2003,113(9):1588-1594.

　　[15]Rhee JG,Li D,Suntharalingam M,et al.Radiosensitization of head/neck squamous cell carcinoma by adenovirus-mediated expression of the Nbs1 protein[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，2007,67(1):273-278.

　　[16]Tounekti O,Kenani A,ForayN, et al.The ratio of single to double strand DNA breaks and their absolute values determine cell death pathway[J].Br J Cancer,2001,84:1272-1279.

　　[17]Tran HM,Shi G,Li G,et al.Mutant Nbs1 enhances cisplatin-induced DNA damage and cytotoxicity in head and neck cancer[J].Otolaryngol Head Neck Surg，2004,131(4):477-484.