钙蛋白酶和钙蛋白酶抑素在老年聋大鼠耳蜗中的表达

　　作者：王苹 汤勇 杜波 杜宝东 肖北春 作者单位：吉林大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科，吉林 长春 130021

　　【摘要】 目的 确定钙蛋白酶在老年聋大鼠耳蜗中的表达和钙蛋白酶-钙蛋白酶抑素平衡变化与老年耳聋的相关性。方法 采用免疫组织化学染色确定钙蛋白酶在老年大鼠耳蜗中的表达水平和组织定位，采用即时PCR技术分析耳蜗提取物中钙蛋白酶和钙蛋白酶抑素 mRNA水平的变化。结果 钙蛋白酶主要分布在耳蜗组织的内外毛细胞、神经元细胞和血管纹。在青年组大鼠耳蜗组织中钙蛋白酶有低水平表达，在老年大鼠耳蜗中的表达明显高于青年组。不同程度耳聋的耳蜗毛细胞、神经元和血管纹的钙蛋白酶表达趋势相似。但钙蛋白酶在血管纹中表达低于神经元和毛细胞。在老年耳聋组，耳蜗提取物中的钙蛋白酶 mRNA水平比青年组增高57倍(P<001)，而钙蛋白酶抑素的mRNA水平减低了3倍(P<001)。结论 钙蛋白酶钙蛋白酶抑素系统平衡紊乱在老年耳蜗组织退化和听力障碍发生过程中有重要作用。

　　【关键词】 老年性耳聋,钙蛋白酶,钙蛋白酶抑素;耳蜗

　　【Abstract】 Objective To explore the expression of calpain in aging rat cochleas and correlation between change of calpaincalpastatin and agerelated hearing loss.Methods Immunohistochemical staining were used to detect the expression and location of calpain in aging rat cochleas, and real time PCR assay were used to detect mRNA level of calpain and calpastatin in cochlear extracts.Results Calpain distributed in outer and inner hair cells, spiral ganglion or stria vascularis. Lower expressions were seen in younger rat cochlear tissues. Calpain expression significantly increased in aging rats than those in younger rats in hair cells, spiral ganglion and stria vascularis. There was a similar expressing pattern in the aging rats with different auditory brain response (ABR) threshold. mRNA level of calpain increased 5.7fold in aging rats cochleas than that in younger rats. In contrast, mRNA level of calpastatin decreased 3fold (P<0.01). Conclusions The functional disorders of calpain and calpastatin could play an important role in cochlear tissue degeneration and hearing lesion by agerelated hearing loss.

　　【Key words】 Agerelated hearing loss; Calpain; Calpastatin; Cochleas

　　在许多神经元损害的过程中伴随着细胞内钙离子增高的过程，钙离子浓度过高可抑制ATP的合成同时也抑制Na+K+ATP酶的活性而导致细胞内的能量合成和利用障碍。但细胞内高钙浓度的最大潜在威胁是激活钙蛋白酶(Calpain)的活动。Calpain 的激活往往是细胞凋亡和变性坏死的早期信号〔1〕。老年聋是一种随增龄而发生的进行性感音神经性耳聋，是听力丧失的一种非常普遍的形式。其病理学特征是内外毛细胞的受损、耳蜗血管纹萎缩、耳蜗螺旋神经节细胞和神经纤维的退行性变以及听觉中枢异常。虽然有关老年性耳聋机制的研究很多，但是仍有许多疑问无法解释。文献报道，钙蛋白酶激活与老年性痴呆的神经退行性病变密切相关〔2〕。本文通过检测钙蛋白酶和钙蛋白酶抑素在老年大鼠耳蜗组织中的表达，确定钙蛋白酶钙蛋白酶抑素平衡变化与老年耳聋的相关性。

　　1 材料与方法

　　11 实验分组 24～36月龄的Wistar大鼠25只，无噪声暴露及药物使用史、无中耳炎。根据ABR检测阈值分为两组，轻度耳聋组10只，ABR阈值为(385±865)dB SPL ，中度耳聋组15只，ABR阈值为(655±1765)dB SPL。以3月龄的青年大鼠为正常对照。

　　12 免疫组织化学染色 免疫组织化学方法采用SABC法，试剂盒购自武汉博士德生物技术公司。取双侧耳蜗，10%福尔马林固定24 h，经10%EDTA脱钙3～7 d，制成4 μm石蜡切片，经脱蜡至水，滴加一抗(antimcalpain 1:50，4℃过夜，PBS冲洗3×3 min，加生物素标记的第二抗体，室温孵育10 min;PBS冲洗3×3 min，加1滴SABC试剂，室温孵育10 min，用新鲜配制的DAB镜下控制显色2～5 min。苏木素复染，脱水、透明，中性树胶封片。图像处理仪测量钙蛋白酶显色灰度值。

　　13 实时定量PCR 取新鲜耳蜗2个，研碎，Trizol试剂分离耳蜗总RNA。紫外分光光度计检测OD280/OD260比值，估计提取的RNA含量，1%琼脂糖电泳检测RNA完整性。建立一个20 μl的转录体系，加入 5×RT缓冲液 4 μl，OligdT 2 μl，总RNA ，10 μl(2 μg)。 85℃水浴5 min，打开RNA的二级结构。离心数秒。加入dNTP(10 mmol/L，Sigma)2 μl，RNA酶抑制剂 1 μl， AMV(10 U/μl，Promega公司)1 μl。42℃，1 h逆转录反应，95℃，10 min灭活AMV。PCR反应使用MJR公司的SYBR Green I PCR 试剂盒。mCalpain引物：Forward:5′-TCCTTCAGTGACTTCCTGAG3′，Reverse:5′ GAGAAGACTCGGATGCACAA5′。Calpastatin引物Forward:5′ AATGCTGCTTTGGATGACCTG3′，Reverse:5′ACCTGTACTCAGCAGGTACTG3′。 在20 μl反应体系，加入10 μl of Master SYBR Green I mix 10 μl，引物 mix 5 μl(125 nmol/L)，cDNA 5 μl(40 ng)，PCR反应程序：预变性95℃，10 min、94℃，1 min、60℃，50 s、72℃，50 s， 35个循环，延伸7 min。延伸时读板，收集荧光值。以GAPDH作为内参照，计算产物相对量。mRNA的相对含量计算公式：相对表达量= 2△( △Ct),其中 △Ct=Ct(target)Ct(GAPDH)和△(△Ct)=△Ct(实验组)△Ct(对照组)。

　　14 统计学分析 所有数据以x±s表示。统计学分析使用Sigma Stat 203 (sigma)软件，采用one way ANOVA检验。

　　2 结果

　　21 钙蛋白酶在耳蜗组织中的表达定位 钙蛋白酶的阳性染色颗粒为黄褐色，主要分布在在耳蜗组织的内外毛细胞、神经元细胞和血管纹细胞的胞浆和细胞膜表面(见图1)。在青年组大鼠耳蜗组织中钙蛋白酶有低水平表达，老年大鼠耳蜗钙蛋白酶表达明显增强，采用图像分析技术分析耳蜗组织中钙蛋白酶的表达灰度值(见表1)。定量分析结果显示，老年大鼠的耳蜗毛细胞和神经元中，钙蛋白酶的表达与青年组相比明显增加。不同程度耳聋的老年组的耳蜗毛细胞、神经元和血管纹的钙蛋白酶表达趋势相似。但血管纹钙蛋白酶表达低于神经元和毛细胞。

　　22 使用实时定量 PCR技术对老年大鼠耳蜗器官钙蛋白酶和钙蛋白酶抑素的mRNA水平检测结果发现，老年耳聋组，耳蜗提取物中的钙蛋白酶 mRNA水平增高57倍(P<001)，而钙蛋白酶抑素的mRNA水平减低了3倍(P<001)。表明耳蜗组织钙蛋白酶转录增强可能与钙蛋白酶抑素表达降低有关(见图2)。

　　表1 老年大鼠耳蜗组织中钙蛋白酶的表达(略)

　　与青年组相比：1)P<0001

　　A:老年性耳聋组(A1:毛细胞 A2:螺旋神经元 A3:血管纹) B:青年组(B1:毛细胞 B2:螺旋神经元 B3:血管纹

　　图1 老年大鼠耳蜗组织中钙蛋白酶的表达(200×)(略)

　　图2 老年大鼠耳蜗钙蛋白酶和钙蛋白酶抑素mRNA水平(略)

　　3 讨论

　　一些研究发现，毛细胞丢失导致了耳蜗螺旋神经元(SGNs)的死亡是老年聋的主要病理学特征。1998年方耀云〔3〕在国内首先报道了老年人SGNs形态学变化，随着增龄，SGNs逐渐减少，细胞大小不等，核浓缩，而且神经纤维也减少。有关耳蜗毛细胞和神经元的退行性死亡形式和激活死亡的途径目前报道很少。Caspases作为细胞凋亡因子在受损伤的神经组织中活性增强，但是在退行性病变的耳蜗组织，Caspases系统的作用并不明显。在长期应用卡那霉素导致的耳蜗毛细胞和SGNs死亡过程中没有Caspase3，9的激活〔4〕。 Riva等〔5〕在观察不同生长时期的CD1老年模型鼠耳蜗退行性病变过程中凋亡相关基因的表达时发现Caspase3仅在耳蜗神经元区域的神经胶质细胞内过表达。在Caspase3(-/-)基因缺欠鼠模型，其ABR阈值增高，SGNs退行性死亡。因此推测存在独立于Caspases系统的SGNs退行性死亡机制〔6〕。使用钙蛋白酶降解产物的特异抗体对卡那霉素损伤的耳蜗进行免疫组织化分析，发现在毛细胞和耳蜗神经元中钙蛋白酶活性增强〔7〕。在这个研究中我们发现，mcalpain在老年大鼠耳蜗毛细胞表达最强，其次为螺旋神经元和血管纹。推测钙蛋白酶参与老年耳聋的发生，其耳蜗组织退行性病变的组织次序与钙蛋白酶密切相关。结果还显示mCalpain表达强度与老年性耳聋的听力下降程度没有明显的相关性。我们认为钙蛋白酶激活诱导听力障碍主要是耳蜗组织退化的结果，能量代谢水平高的细胞钙蛋白酶活性高，而钙蛋白酶诱导细胞凋亡主要是线粒体信号传导途径。

　　钙蛋白酶内源性抑制剂-钙蛋白酶抑素是唯一针对钙蛋白酶的细胞内蛋白。它通过与钙蛋白酶的活性区域结合实现对钙蛋白酶的阻断作用。钙蛋白酶的外源性抑制剂-Leupeptin可阻断庆大霉素所致的耳蜗和前庭毛细胞损害，还可以保护毛细胞免于强噪声的杀伤。Leupeptin能够维持体外缺氧状态下的耳蜗神经元存活，抑制细胞凋亡〔8，9〕。在老年大鼠的肾组织中发现， 钙蛋白酶过度激活与降低的钙蛋白酶抑素密切相关。我们采用实时PCR的方法分析了老年大鼠耳蜗提取物的钙蛋白酶和钙蛋白酶抑素的mRNA水平，结果发现青年组大鼠耳蜗钙蛋白酶和钙蛋白酶抑素维持在一定水平;老年组耳蜗组织中钙蛋白酶的转录增强，而钙蛋白酶抑素的mRNA水平却比青年组低3倍。这些结果表明， 钙蛋白酶和钙蛋白酶抑素系统平衡紊乱在老年耳蜗组织退化和听力障碍发生过程中有重要作用。我们推测老化的耳蜗组织Ca2+浓度增高和钙蛋白酶抑素的表达抑制，使钙蛋白酶活性增强，过量的钙蛋白酶降解线粒体膜蛋白，线粒体内细胞色素C释放，导致细胞死亡可能是耳蜗细胞退行性病变的主要途径之一。

　　老年聋发病率高，而且很难恢复损失的听力。尽管患者可以通过佩戴助听器改善听力，但最佳的治疗方式是人工耳蜗植入，基于我国经济现状，昂贵的手术费用使这个手术很难普遍开展。深入研究老年聋的发病机制，寻找能够维持内耳毛细胞和神经元存活的因子，体外化学合成功能相似的药物应用于临床，对于延缓老年聋的发展速度，提高老年人的生活质量有重要意义。

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