抗肿瘤光催化氧化剂纳米TiO2的研究进展

　　作者：黄金樵,综述,程金妹,林昶　　作者单位：福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科, 福州 350004

　　【摘要】阐述纳米TiO2的结构特征、制备方法及其光催化氧化作用、抗肿瘤的机理,综合分析研究现状,并展望今后纳米TiO2在医学领域的研究方向。

　　【关键词】 二氧化钛 光催化氧化 肿瘤 机理

　　光催化氧化技术是一种始于20世纪70年代的高级氧化技术。自从1985年日本学者Matsunaga等[1]首次报道光激发TiO2具有杀菌效果以来,TiO2光催化氧化在生物领域的应用研究引起了化学家、化学工程师和微生物学家的极大关注,并很快成为研究的热点[2]。由于纳米TiO2在紫外线照射下,产生的活性氧类与空穴等组分能对肿瘤细胞内外的生物大分子产生强氧化作用,从而有效地杀伤癌细胞[3]。此外,纳米TiO2能被正常组织内血管周围的巨噬细胞所吞噬,不会引起白细胞减少等毒副作用[4]。

　　肿瘤光动力学疗法作为一种微创治疗肿瘤的新技术,可有效地改善患者症状,提高生活质量和延长生存期。光动力反应是指把有氧分子参与的伴随生物学效应的光敏反应。光敏剂是指能吸收特定波长光的能量并传递给周围的分子,从而产生活性氧等毒性物质的一类化学物质。故探索利用纳米TiO2作为光敏剂的光动力疗法治疗肿瘤具有理论价值和现实意义

　　因此,具有抗肿瘤前景的纳米TiO2日趋受到医学领域的关注,并积累了相关的理论研究,纳米TiO2很可能成为21世纪的新型抗肿瘤药剂。本文归纳总结了前人对光氧化催化剂纳米TiO2研究的成果,着重从以下几方面进行阐述。

　　1 纳米TiO2的结构特征及其制备方法

　　1.1 结构特征 TiO2晶体主要存在锐钛型、金红石型、板钛型等三种结构晶型,这三种晶型的共同特征是以TiO6八面体为基本结构单元,金红石型和板钛型TiO2是由TiO6八面体共边构成,而锐钛型TiO2则是由TiO6八面体共顶点组成。金红石型和板钛型是畸变的八面体,锐钛型实际上可以看作一种四面体结构。锐钛型在低温下稳定,高温时则转化为金红石型[5]。其中锐钛型TiO2和金红石型TiO2具有光催化活性。许多研究表明，锐钛型TiO2的光催化活性优于金红石型[6]。

　　1.2 制备方法 由于纳米TiO2具有稳定性好、光催化活性高、价廉以及对人体基本无毒等优点,使它日趋受到人们青睐。因此,开展TiO2纳米粒子制备的研究对合成高活性的光催化剂具有重要的指导意义[7]。制备TiO2纳米粒子的方法很多,一般分为物理和化学方法两大类。化学法又分为气相法和液相法。纳米TiO2的制备一般采用气相法和液相法。

　　1.2.1 物理方法[8] 本法是最早采用的纳米材料制备方法,主要通过高能消耗方式,强制材料细化,从而得到纳米材料。物理方法的优点是产品纯度高。

　　1.2.2 气相法[910] 本法是直接利用气体或者通过各种手段,把物质变成气体,使之在气体状态下发生物理变化或化学反应,最后在冷却过程中凝聚长大形成纳米微粒的方法。气相法中,有气相热解法和气相水解法。气相法虽可制得具有较高质量的纳米TiO2粉末,但气相反应需要使物料气化,能耗较高。

　　1.2.3 液相法 本法制备TiO2纳米粒子主要有沉淀法、溶胶凝胶法、水热反应法、微乳溶液法。

　　1.2.3.1 沉淀法[1011] 可分为直接水解法、均匀沉淀法和共沉淀法。是以一种或多种离子的可溶性盐(TiCl4、Ti0SO4等无机钛盐或有机钛醇盐)溶液为原料,然后加入适当的沉淀剂〔(NH4)2CO3、NaOH或NH4OH〕,在一定的温度下使溶液发生水解,形成不溶性的Ti(OH)4沉淀,再将Ti(OH)4经过滤、洗涤、干燥和焙烧得到TiO2。然后以无机钛盐作为前驱物,在强烈搅拌下缓慢滴人蒸馏水或碱液中,生成均匀沉淀,再经分离、洗涤、烘干、热处理等过程,最后得到TiO2超细粉体。

　　1.2.3.2 溶胶-凝胶(Solgel)法[1213] 通常将先驱体(钛醇盐如钛酸四丁醋等)溶于溶剂(乙醇、异丙醇等)形成均匀的溶液,接着溶质在溶液中发生水解或醇解,同时失水、失醇缩聚形成溶胶,再经过干燥、研磨、锻烧后得到纳米TiO2粉体。该法具有反应温度低(通常在常温下进行)、设备简单、重复性好等优点,是近年来被广泛采用的制备TiO2纳米粒子的方法。

　　1.2.3.3 水热反应法[1416] 在密闭的高压反应器中,高温高压下在水溶液或水蒸气等流体中进行的一系列化学反应的总称。该法不需要高温焙烧就能直接得到晶型好的粉体TiO2,避免了高温焙烧时硬团聚的形成,但水热反应完成后TiO2纳米微粒和杂质离子的分离难以解决,且操作复杂,对设备要求高。

　　1.2.3.4 微乳溶液法[10,1718] 通过混合两种含有不同反应物的微乳液实现的。通常将两种反应物分别溶于组成完全相同的两份微乳液中,然后在一定条件下混合,两种反应物通过物质交换而彼此遭遇,产生反应。然后经过超速离心使纳米微粉与微乳液分离,再以有机溶剂去除附着在表面的油和表面活性剂,最后经干燥处理,得到纳米微粒的固体样品。微乳法不需加热、设备简单、操作容易、粒子可控,但使用的大量表面活性剂难以完全除去。目前这种方法尚处于研究阶段。

　　此外还有H2O2氧化法、微波热液合成法、TiOCl2法等,但这些方法成本较高,应用范围不广。目前应用于抗肿瘤纳米TiO2的研究较多的为TiO2薄膜,其制备方法有阳极氧化法、溶胶-凝胶法、液相沉积法、电沉积法、涂覆法、磁控溅射法等。

　　2 纳米TiO2光催化氧化作用的机理

　　纳米TiO2是一种n型半导体材料,其能带结构是由一个充满电子的低能价带和一个空的高能导带构成,价带和导带之间的区域为禁带,禁带的宽度为带隙能。纳米TiO2带隙能为3.0～3.2eV,相当于波长为387.5nm的光子能量。当用能量大于或等于带隙能的光照射TiO2时,处于价带上的电子就会被激发并跃迁至导带,从而分别在价带和导带上产生高活性的光生空穴(h+)和光生电子(e-),光生空穴具有强氧化性,光生电子具有强还原性。TiO2粒子能带间缺少连续区域,因而光生电子-空穴对的寿命较长。在空间电荷层电场的作用下,电子和空穴有效地分离并迁移到TiO2颗粒表面的不同位置[1920]。若置TiO2于水中,则吸附于TiO2颗粒表面的水分子被光生空穴氧化,生成氧化能力和反应活性极强的•OH(氢氧自由基)。水中溶解的氧可同时被光生电子还原,生成OH-,H2O2,HO2•等活性氧类。其主要反应机理[21,22]如下所示:

　　① TiO2+hν→h++e-

　　② h++H2O→•OH+H+

　　③ e-+O2→•O2-

　　④ •O2-+H+→HO2•

　　⑤ 2HO2•→O2+H2O2

　　⑥ H2O2+•O2-→•OH+OH-+O2

　　…

　　3 纳米TiO2光催化氧化抗肿瘤机理的研究

　　国内外有关纳米TiO2光催化氧化抗肿瘤细胞的报道较少，日本学者藤岛昭是纳米TiO2光催化氧化杀灭肿瘤研究的最早开拓者，关于纳米TiO2的杀伤细胞的作用机理在国外研究较多。随着研究的不断深入,各学者对纳米TiO2的光催化氧化杀伤细胞机制提出了不同的的观点,主要有以下几种。

　　3.1 DNA和RNA分子的损害 Hidaka等[23]提出了纳米TiO2在光照下能催化氧化杀伤DNA和RNA分子。Dunford等[24]于体外在TiO2和近紫外光照射超螺旋的质粒DNA下,确信羟基是造成DNA断裂的主要因素,并且进一步分析出鸟嘌呤是DNA分子改变的基础。Wamer等[25]用紫外光照射加有TiO2颗粒的小牛胸腺DNA,发现鸟嘌呤基的羟基化作用,且羟基化的的程度与TiO2浓度和紫外光的强度呈正相关。当用人类成纤维细胞在同样条件作体内试验时,作者检测到细胞内RNA有高水平的羟基化作用,但却没有检测到细胞内DNA的羟基化。

　　3.2 催化特异性DNA位置损害的机理 Hirakawa等[26]提出有Cu2+存在时,光照射TiO2颗粒催化DNA的损害。锐钛型TiO2引起的DNA损害强于金红石型。在体外主要通过光催化反应产生的H2O2而不是羟自由基引起铜依赖的DNA损害,从而杀伤细胞。尽管TiO2不可能结合到细胞核内,但光催化反应产生的H2O2很容易扩散并结合到细胞里,导致DNA损害。

　　3.3 细胞渗透机理 支持此观点的研究者发现了光照TiO2可导致细胞壁、细胞膜的破坏及细胞内容物泄漏。Saito等[27]研究表兄链球菌自身溶血试验时,在光照TiO2下发现了钾离子在3min内迅速从细胞内漏出,同时伴随着细胞死亡。当在反应后增加高浓度的K+时,失活的细胞不能逆转。因此,Saito等认为K+的漏出仅仅表明细胞膜的不完整性,而不是导致细胞死亡的直接原因。所以我们认为纳米TiO2在光照下首先引起细胞膜屏障的破坏,从而其半通透性增加,最终导致细胞的死亡。

　　Sakai等[2829]的研究也证实了光照纳米TiO2可引起细胞膜损害进而杀伤细胞的作用。他们在加入浓度为10～100μg/mL TiO2的F12培养液中将T24细胞(人体膀胱癌细胞)在暗室下培养24h,然后通过电镜扫描图发现,TiO2不仅分布在细胞膜表面,也分布在细胞质中,可能是通过细胞的吞噬作用。随后作者还发现了光照TiO2在0～4min和5～10min出现Ca2+内流的两个阶段,引起细胞内Ca2+的迅速增加。而Ca2+内流是细胞膜通透性增高的表现,最后导致细胞死亡。我们认为，导致细胞死亡的原因是活性氧类对含不饱和磷脂细胞膜的攻击,这些活性氧类包括光照纳米TiO2颗粒下所产生的羟自由基、超氧自由基、过氧化氢等。

　　总之,细胞膜的不饱和磷脂是脂质过氧化反应的潜在目标。一旦纳米TiO2损坏细胞膜屏障或通过细胞吞噬作用进入细胞内,就能对细胞内所有的主要成分进行光催化杀伤作用。纳米TiO2通过光催化氧化杀伤癌细胞的机制至今尚未明确,可能是多种机制共同作用的结果。

　　4 纳米TiO2光催化氧化技术抗肿瘤的研究现状

　　4.1 纳米TiO2抗肿瘤的国外研究现状 日本科学家Fujishima等率先研究发现纳米TiO2在紫外光照射下可以杀死Hela肿瘤细胞。他随后展开了一系列研究,对不同条件下杀死肿瘤细胞的影响因素进行探讨,发现使用极化TiO2微电极可进行选择性杀死单个肿瘤细胞[30]。结果表明了光催化纳米TiO2对肿瘤细胞有明显的杀伤作用,产生的活性氧对细胞膜中脂类物质进行氧化作用,导致细胞膜通透性增大,大量钙离子内流,从而诱发细胞凋亡。

　　4.2 纳米TiO2抗肿瘤的国内研究现状 纳米TiO2的抗肿瘤研究日益受到重视,也取得了一些可喜的进展。熊先立等[31]通过流式细胞仪分析纳米TiO2对人肝癌细胞系BeI7402细胞周期的影响,细胞周期的分析结果表明,纳米TiO2能使Bel7402细胞的G1期细胞数明显增加,S期数量减少,说明纳米TiO2可将细胞周期阻滞于G1期,而不能进入S期。可阻止受损的细胞进入S期,使细胞直接从G1期脱离细胞周期而进入死亡程序,导致细胞生长抑制。

　　张爱平等[32]在体外对胃癌细胞分别进行了紫外光、TiO2的空白实验以及紫外光照纳米TiO2光催化杀伤的对照实验,并使用流式细胞仪及碘化丙啶(PI)荧光染色法检测了细胞的存活状态。结果表明,纳米TiO2通过光催化对胃癌细胞有明显杀伤作用。在光强为1.06×10-3W/cm2、TiO2比负载量为9.8×10-7g /cm2、光照40min条件下对胃癌细胞的光催化氧化杀伤率达80%。

　　朱融融等[33]通过四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)、酶标仪检测、倒置显微镜观察和DNAladder实验等方法以人肾上皮细胞293T和中国仓鼠卵巢肿瘤细胞CHO为对象,研究结果表明,纳米TiO2对肿瘤细胞具有非常明显的毒性作用,可侵入细胞内部,诱导CHO细胞产生细胞凋亡。对于293T细胞,虽然会抑制其增殖,但不能够进入细胞膜内,没有细胞凋亡现象的发生。

　　夏春辉等[34]在光催化纳米TiO2条件下,采用HE染色法和MTT法,研究了纳米TiO2对Bel7402人体肝癌细胞的杀伤作用。结果发现,在光催化下适宜的TiO2浓度对Bel7402细胞具有较高的抑制效应,同时抑制过程表现出类似一级反应的动力学规律。光催化纳米TiO2产生的活性氧物质与癌细胞膜内外的生物大分子反应,引起广泛的细胞结构破坏;能够造成癌细胞内Ca2+稳态失去平衡;引发细胞微管相关蛋白2(MAP2)表达的变化,促进微管发生重组,导致细胞凋亡和坏死。

　　5 展望

　　纳米TiO2光催化氧化技术具有广阔的应用前景,它对于节约能源、降低污染治理成本、改善人类生活质量以及实现可持续发展等方面都有着十分重大的意义。在不久的将来,它的实用化和广泛应用必将给我们带来极大的社会效益和经济效益。

　　虽然纳米TiO2的抗肿瘤研究取得了很大的进展,但还有很多问题需要进一步的研究和解决,例如由于紫外光的穿透性较差,对于体内肿瘤需用紫外光光纤针作为介导,给治疗带来不便,纳米TiO2真正应用于临床抗肿瘤还有一段很长的路,其中基础研究的不断深入和积累是必要的前提条件。对于纳米TiO2详细的抗肿瘤机理、如何提高纳米TiO2的杀伤肿瘤细胞效率以及纳米TiO2的临床应用等方面将是今后纳米TiO2在医学领域的研究重点。

　　随着人们对纳米TiO2抗肿瘤作用的大量基础理论研究的不断深入,纳米TiO2将成为在医学领域的一类具有很大发展潜力和应用前景的抗肿瘤光催化氧化剂。