多发性脑梗死性痴呆模型的形态学研究

　　作者：应凤博 薛景凤 高燕军 米艳娟 赵晓丽 陈志宏 作者单位：承德医学院附属医院神经内科，河北 承德 067000

　　【摘要】 目的 建立一种有机微血栓所导致的多发性脑梗死性痴呆动物模型，评价其可靠性和实用性。方法 将Wistar成年大鼠随机分为正常对照组(不给予任何处置)、模型组(于左侧颈外动脉逆行插管至左侧颈总动脉分叉处，注入有机微血栓0.5 ml,造成多发性脑梗死动物模型)、假手术组(于左侧颈外动脉逆行插管至左侧颈总动脉分叉处，向颈内动脉内注入生理盐水0.5 ml)。应用光镜观察多发性脑梗死性痴呆大鼠海马的形态学改变。结果 造模后脑内存在广泛而多发的梗死灶，以海马区梗死发生率为最高。结论 建立的模型与临床上多发性脑梗死性痴呆病人相似，是进行多发性脑梗死性痴呆基础研究和临床研究的理想动物模型。

　　【关键词】 多发性脑梗死性痴呆;动物模型;大鼠;海马;形态学

　　自1979年Pulsinelli采用大鼠四血管阻断法(4VO)〔1〕进行血管性痴呆动物模型研究以来，血管性痴呆大鼠模型有数种，但是关于多发梗死性痴呆模型的研究不多，且所制作的多发梗死性痴呆模型都是模拟人类MID的某一个侧面来完成的，与接近人类实际情况的MID还有一定偏离，尚需不断完善。本研究参照Kaneko〔2～4〕等方法加以改进，利用正常人血浆纤维蛋白创造一种有机微血栓，进而建立一种有机微血栓所导致的多发性脑梗死性痴呆动物模型。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 Wistar成年大鼠60只，10月龄，体重250～350 g，雌雄不拘，由首都医科大学动物科学部提供。将60只大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组，每组20只。各组大鼠均经Morris水迷宫实验初筛，2 min内游上安全平台者为合格，否则剔除。

　　1.2 药物、试剂与仪器 凝血酶(规格500 U,由黑龙江迪龙制药有限公司生产)，生理盐水，水合氯醛，多聚甲醛，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，蛋白甘油，焦油紫，苏木精，伊红，酒精，二甲苯，4%红四氮唑等。Morris水迷宫由中国医学科学院药物研究所生产，超声波细胞粉碎机(型号JY922D，由宁波新芝生物科技股份有限公司生产)，手术显微镜，微型动脉夹，离心机，电子天平，振荡切片机(型号LEICA VT 1000 S)，Olympus光学显微镜，测微尺，恒温箱等。

　　1.3 方法

　　1.3.1 有机微血栓的制备 取正常人血浆(含血小板)1 ml迅速加入凝血酶500 U，凝固后反复漂洗，用超声波细胞粉碎机将其打碎，使栓子直径多在20～40 μm，再用生理盐水将其配成10 mg/ml的栓子混悬液。

　　1.3.2 模型制备 用10%水合氯醛(35 mg/100 g)腹腔内注射麻醉。选择大鼠左侧为实验侧，于左侧颈外动脉逆行插管至左侧颈总动脉的分叉处后，注入栓子混悬液0.5 ml，推注同时开放夹闭的颈总动脉，使栓子通过颈内动脉进入颅内至大脑各动脉，造成多发性脑梗死动物模型。假手术组手术方法同模型组，向颈内动脉注入生理盐水0.5 ml。正常对照组不给予任何处理。造模术后第8天采用Morris水迷宫实验进行行为学测试，观察定位航行实验和空间探索实验，确定多发性脑梗死性痴呆大鼠。

　　1.3.3 形态学观察 组织切片的制备：取正常对照组5只、假手术组5只、模型组10只用以形态学方法观察。行为学测试完成后，在10%的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔内注射麻醉下，打开胸腔，升主动脉插管，先用温生理盐水100 ml快速冲洗血管，继之用4%多聚甲醛0.1 mmol/L磷酸缓冲液(pH7.2～7.4)进行灌流固定，持续2 h后，开颅取脑，将脑组织浸入4%多聚甲醛0.1 mmol/L磷酸缓冲液(pH7.2～7.4)内固定保存。取视交叉至脚间窝之间的一段脑组织(海马所在部位)，应用LEICA VT 1000S型振荡切片机作连续冠状切片(片厚30 μm)，分别裱片于涂有蛋白甘油的载物片上，放入恒温箱烘干，将这些连续冠状切片按编号的单、双数分成两套，然后分别进行尼氏(Nissl)染色和HE染色，分色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察海马细胞的形态学变化。

　　2 结果

　　2.1 HE染色 模型组梗死率达100%。模型组实验侧脑组织多部位均可见点片状局部缺血性改变，神经细胞胞体不同程度缩小、核固缩、核碎裂、核溶解，可见失去正常结构的红色神经元和格子细胞(图1)。梗死灶中可见巨噬细胞、细胞脱失，大量胶质细胞增生。正常对照组和假手术组及模型组正常侧无上述病理改变。

　　2.2 Nissl染色 低倍镜：正常对照组和假手术组及模型组正常侧海马各层细胞排列紧密，层次分明，细胞核及尼氏体均无任何改变;模型组实验侧海马CA1、CA2、CA3、垂直部、齿状回梗死区可见细胞排列稀疏，有明显的细胞脱失，大量的胶质细胞增生(图2)。高倍镜：正常对照组和假手术组及模型组正常侧各层细胞核膜完整，尼氏体清晰可见，细胞排列紧密;模型组海马CA1、CA2、CA3、垂直部、齿状回梗死区形态正常的细胞数明显减少，许多细胞结构不完整，大量的胶质细胞增生。在梗死灶附近可见周围细胞有明显改变，胞浆内尼氏体减少，甚至消失，核溶解(图3)。

　　图1 模型组大鼠海马CA3区形态学变化(HE染色，×200)(略)

　　图2 模型组大鼠实验侧海马CA1和CA2形态改变(Nissl染色，×40) (略)

　　图3 模型组大鼠实验侧海马CA2形态改变(Nissl染色，×200)(略)

　　3 讨论

　　以往报道的血栓多为人或动物全血凝固后形成的“红色血栓”，其主要成分为红细胞、血小板，纤维蛋白含量较少，松软易碎，在体内易自溶，栓塞血管可自然再通〔5〕。本模型所用血栓克服了上述缺点，它是由含血小板的健康人血浆凝固而成的“白色血栓”，更接近于人类血栓栓子的成分，其主要成分为纤维蛋白，含少量血小板，柔软而且有韧性，不易早期自溶。

　　本研究形态学观察发现，大多痴呆模型大鼠可见在海马不同区域有不同程度的细胞脱失、红色神经元和格子细胞、大量的胶质细胞增生等，这些形态学变化印证了行为学的结果。少数痴呆模型大鼠在海马未发现异常，但在额叶皮质、顶叶皮质深层、背侧丘脑、尾状核、壳核、内囊、胼胝体、齿状回等部位发现栓子，且栓塞的血管不固定，在梗死附近可见周围细胞明显改变，说明痴呆与海马之外的其他脑组织结构有关，也与梗死灶的多少有关。大量的研究结果表明，海马是大鼠参与空间认知加工过程的主要结构，但并非惟一的空间认知结构，同时其他一些脑结构亦对空间认知的行为产生影响，单纯毁损额顶叶、颞叶、尾壳核、隔区等都产生空间认知功能障碍。认知功能的完整还有赖于皮质下各脑区大量纤维的完整。本模型缺血确切，病灶多发，不固定，大鼠没有明显的肢体运动障碍，死亡率低，痴呆率高，存活率高，存活期长，手术操作简单，尤其是以学习记忆能力低下为主要特点，与临床多发性脑梗死性痴呆的发病过程相似，适用于大批实验，值得广泛推广使用。

　　本研究观察海马的形态学变化时还发现，有的痴呆大鼠在海马的不同区同时出现细胞排列稀疏，有明显的细胞脱失，大量的胶质细胞增生。这提示栓子微小，可能同时栓塞2个或者更多个海马动脉的细小分支,也可能是栓塞的海马动脉的细小分支同时供应海马的不同区。

　　【参考文献】

　　1 贾健民，贾健平.大鼠脑反复缺血致不可逆性学习记忆障碍的研究〔J〕.心理学报，1995;27(1)：6971.

　　2 Kaneko D,Nakamura N,Ogawa T.Cerebral infarction in rats using homologous blood emboli：Development of a new experimental model〔J〕. Stroke，1985;16:7684.

　　3 陈俊抛，田时雨，于微微，等.多发性脑梗死痴呆动物模型的研究〔J〕.中华神经精神科杂志,1994;27(5)：3112.

　　4 陈衔城，秦智勇，张福林.猪脑栓塞动物模型的建立及评价〔J〕.中国临床神经科学，1998;6(1)：68.

　　5 Lyden PD，Zivin JA，Chabolla DR，et al.Quantitative effects of cerebral infarction on spatial learning in the rats〔J〕.Exp Neurol,1992;16:12232.