大鼠脑缺血再灌注损伤后NogoA及IGF1的表达和意义

　　作者：杜秀民 刘红 刘广义 作者单位：青岛大学医学院附属海慈医院神经内科，山东 青岛 266033

　　【摘要】 目的 探讨大鼠脑缺血再灌注(IR)损伤后髓鞘相关蛋白(NogoA)和胰岛素样生长因子I(IGF1)的表达和意义。方法 成年健康雄性Wistar大鼠72只，随机分为NogoA组和IGF1组，每组各36只。应用线栓法制备大鼠大脑中动脉IR动物模型，免疫组织化学方法检测NogoA与IGF1在神经元凋亡中的表达。结果 假手术组TUNEL凋亡神经细胞较少，脑IR 2 h海马区、皮质区及纹状体区细胞凋亡逐渐增加，7 d细胞凋亡达高峰，14 d降低。脑IR 2 h～14 d，NogoA表达明显增加，皮质区和纹状体区再灌注12 h和48 h出现两个表达高峰，海马区再灌注24 h出现一个高峰。脑IR 2 h～14 d神经细胞IGF1表达明显增加，24 h达最高峰，14 d仍维持高值水平。结论 NogoA与IGF1参与抑制并促进神经元轴突再生的表达。

　　【关键词】 脑缺血再灌注;NogoA;IGF1;神经元;凋亡

　　基金项目：青岛市科技局基金资助项目(051NS73)

　　髓鞘相关蛋白神经突起生长抑制分子Nogo具有NogoA、NogoB、NogoC三种主要异构体，都会引起神经突起生长锥的崩解〔1〕，其中以NogoA与神经再生的关系最为密切〔2〕。研究证实NogoA广泛表达于中枢神经系统〔3，4〕。胰岛素样生长因子1(IGF1)属胰岛素家族成员之一，广泛存在于正常脑组织中，参与脑的发育，促进神经元的存活、分裂和轴突的生长以及维持和调节神经功能，并有助于神经细胞受损后的功能恢复。本实验观察大鼠局灶性脑缺血再灌注(IR)损伤后NogoA蛋白和IGF1蛋白表达的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 局灶性IR动物模型的建立 成年健康雄性Wistar大鼠72只，4月龄，体重220～260 g，清洁级，由山东大学实验动物中心提供(批号：鲁动质字20021024)。分为NogoA组和IGF1组，每组36只。各组再随机分为假手术组和脑IR 2、6、12、24、48 h、3、7、14 d组，每组4只(n=4)。应用线栓法经左侧颈外颈内动脉插线建立大脑中动脉闭塞(MCAO)再灌注模型。动物苏醒后，出现左侧Horner征，提尾右前肢屈曲或爬行向右侧划圈者为手术成功的标志。假手术组除不插尼龙线外，余步骤同前。

　　1.2 标本采集和组织切片的制备 各组大鼠在规定时间点内取材，假手术组于手术后1 d取材。大鼠在100 g/L水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉下，用40 g/L多聚甲醛经心脏灌注固定，于前囟前2 mm至前囟后3 mm之间取脑，置入40 g/L多聚甲醛固定2 h，蒸馏水浸泡4 h。常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，连续冠状切片(厚度7 μm)，贴于多聚赖氨酸处理后的玻片上，温室保存备用。

　　1.3 细胞凋亡检测 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。实验步骤按说明书进行。标本切片常规脱蜡、水化，DAB显色。光镜下观察，细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，即凋亡细胞。高倍镜下(400倍)在皮质区、海马区及纹状体区随机各取4个视野计数阳性细胞。

　　1.4 免疫组化检测 兔抗大鼠NogoA和IGF1单克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供，链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶(SP)免疫组化试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。实验步骤按说明书进行，标本切片常规脱蜡、水化，DAB显色，光镜下观察，胞浆呈棕黄色为阳性表达。高倍镜下(400倍)在皮质区、海马区及纹状体区随机各取4个视野计数阳性细胞。

　　1.5 统计学处理及图像分析 采用SPSS11.5统计分析软件。计量资料以x±s表示，组间比较采用F检验。

　　2 结果

　　2.1 TUNEL凋亡细胞检测 假手术组TUNEL标记的凋亡神经细胞较少，散在分布于大鼠海马、皮质区及纹状体区，凋亡细胞核呈棕褐色着色，核固缩呈圆形，核膜完整，核染色质凝集成团块。脑IR 2 h海马区、皮质区及纹状体区细胞凋亡逐渐增加，7 d细胞凋亡达高峰，14 d降低。与假手术组比较有显著性差异(P<0.05)，见表1。

　　表1 大鼠脑IR损伤后TUNEL凋亡神经元的表达(略)

　　与纹状体区比较：1)P<0.05;与海马区比较：2)P<0.05，下表同

　　2.2 NogoA的表达 假手术组海马区、皮质区及纹状体区凋亡神经细胞NogoA呈基础表达。脑IR 2 h～14 d，NogoA表达明显增加，皮质区和纹状体区再灌注12 h和48 h出现两个表达高峰。在海马区仅再灌注24 h出现一个高峰。各时间点与假手术组比较均有显著性差异(P<0.05)，表2。

　　2.3 IGF1的表达 假手术组IGF1阳性细胞在皮质区、海马区及纹状体区具有广泛性表达，阳性神经元胞浆呈棕黄色着色，脑IR 2 h～14 d IGF1表达明显增加，24 h达最高峰，14 d仍维持高值水平。与假手术组比较有显著性差异(P<0.05)，见表3。

　　表2 大鼠脑IR损伤后NogoA阳性神经元的表达(略)

　　表3 大鼠脑IR 损伤后IGF1阳性神经元的表达(略)

　　3 讨论

　　NogoA是在中枢神经系统外伤后具有轴突再生抑制作用的因子，被称为髓鞘相关蛋白。最新研究表明〔3〕，Nogo mRNA广泛分布于胚胎、发育、成年的大鼠海马、大脑皮层神经元胞浆、突起近端内。本实验显示，海马区、皮质区及纹状体区神经元不仅胞浆、突起有NogoA蛋白的表达，而且胞核也出现了极强的NogoA蛋白的表达，与上述报道相一致。NogoA及其受体(NgR)都表达于与轴突生长相关的神经元和少突胶质细胞中。NogoA表达于少突胶质细胞的胞体和突起并定位于髓鞘膜的最内层和最外层〔5〕，这与它抑制轴突生长的作用相一致。闫凤霞等〔6〕研究报道显示，脑IR后侧皮质区和纹状体区NogoA mRNA的表达在脑缺血1 h后再灌2～12 h内达高峰，24 h下降，48 h时又升高，出现第2个高峰，然后逐渐降低，7～14 d降至基础水平，呈现双峰变化。本实验显示，假手术组海马区、皮质区及纹状体区凋亡神经细胞NogoA呈基础表达。IR 2 h～14 d，NogoA表达明显增加，皮质区和纹状体区再灌注12 h和48 h出现两个表达高峰，在海马区仅再灌注24 h出现一个高峰。与上述实验结果相一致，提示NogoA的表达2次达高值的原因，可能主要由于缺血缺氧使细胞失去活性以及再灌注损伤的返弹作用所致。但本研究在海马区只在再灌注24 h出现一次表达高峰，具体原因有待于进一步研究。

　　IGF1对多种刺激因子引起的细胞凋亡有抑制作用，脑缺血时能激发IGF1及其受体的高表达。IGF1可抑制损伤细胞的凋亡过程，从而减少受累神经细胞的死亡。Wang等〔7〕发现在大鼠短暂性大脑中动脉阻塞模型脑表面注射IGF1能使梗死灶体积明显缩小。Hwang等〔8〕研究脑缺血后海马、齿状回神经元和胶质细胞内源性IGF1表达情况，结果表明，缺血早期(12～24 h)IGF1表达增加，且与抑制迟发性神经细胞死亡有关。沈顺姬等〔9〕研究表明，缺血中心区及半暗带区，在缺血2 h即有IGF1 mRNA表达明显增强。缺血半暗带区，IGF1 mRNA 的表达随着缺血时间的延长有逐渐升高的趋势，以至缺血24 h达高峰，缺血48 h仍维持很高水平。本实验显示，假手术组IGF1阳性细胞在皮质区、海马区及纹状体区具有广泛性表达，阳性神经元胞浆呈棕黄色着色，脑IR 2 h～14 d IGF1表达明显增加，24 h达最高峰，14 d仍维持高值水平，其表达规律恰好与细胞凋亡一致，提示IGF1在脑神经组织中的表达变化可能对细胞凋亡具有一致作用，从而保护脑IR对神经细胞的损伤作用。本实验表明，在脑神经损伤后，NogoA蛋白和IGF1蛋白各自发挥着不同的生物作用。NogoA和IGF1蛋白之间相互作用可能是调控神经元凋亡和轴突再生的因素之一。

　　【参考文献】

　　1 Brittis PA，Flanagan JG.Nogo domains and a Nogo receptor：implications for axon regeneration〔J〕.Neuron，2001;30 (1):114.

　　2 Oertle T，Huber C，van der Putten H,et al.Genomic structure and functional characterization of the promoters of human and mouse nogo/rtn4〔J〕.J Mol Biol，2003;325 (2)：299323.

　　3 Josephson A，Widenfalk J，Widmer HW,et al.Nogo mRNA expression in adult and fetal human and rat nervous tissue and in weight drop injury〔J〕.Exp Neurol，2001;169 (2)：31928.

　　4 Hunt D，Coffin RS，Prinjha RK,et al.NogoA expression in the intact and injured nervous system〔J〕.Mol Cell Neurosic，2003;24 (4)：1083102.

　　5 Aketomi M，Kinoshita N，Kimura k,et al.NogoA expression in mature oligodendrocytes of rat spinal cord in association with specific molecules〔J〕.Neurosci Lett，2002;332(1)：37.

　　6 闫凤霞，李永刚，王守彪 等.局灶性脑确血再灌注大鼠NogoA mRNA的表达〔J〕.神经解剖学杂志，2004;20(4)：3948.

　　7 Wang JM，Hayashi T，Whang WR,et al.Reduction of ischemic brain injury by topical application of insulinlike growth factor1 after transient middle cerebral artery occlusion in rats〔J〕.Brain Res，2000;859(2)：3815.

　　8 Hwang IK，Yoo KY，Park SK,et al.Expression and changes of endogenous insulinlike growth factorlin neurons and glia in the gerbil hippocampus and dentate gyrus after ischemic insult〔J〕.Neurochem Int,2004;45 (1)：14956.

　　9 沈顺姬，张淑琴，陈嘉峰，等.大鼠局灶性脑缺血损伤中IGF1 mRNA表达〔J〕.中风与神经疾病杂志，2003;20(4)：3279.