Toll样受体-9在喉鳞状细胞癌中的表达及临床意义

　　作者：李琳 朱冬冬 董震 作者单位：吉林大学中日联谊医院耳鼻咽喉头颈外科，吉林 长春 130033

　　【摘要】 目的 明确Toll样受体-9(Toll like receptor-9，TLR-9)在喉鳞状细胞癌及癌旁正常组织的表达及分布，并探讨其在喉癌发病机制中的作用及临床意义。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，免疫印迹(Western blot)及免疫组织化学技术检测TLR-9在喉癌组织和癌旁正常组织中的表达和分布。 结果 RT-PCR检测表明，TLR-9 mRNA在喉癌及喉正常组织内均有表达，TLR-9在喉癌组织中的表达较癌旁正常组织表达明显增多(t=2.743,P=0.017)，并且在喉癌组织Ⅰ期+Ⅱ期与Ⅲ期+Ⅳ期表达之间差异具有统计学意义(t=1.787,P=0.040)。蛋白质免疫印迹检测发现，癌旁正常组织无TLR-9表达，在喉癌组织Ⅰ期+Ⅱ期与Ⅲ期+Ⅳ期表达之间差异具有统计学意义(t=1.701,P=0.015)，TLR-9的表达位置在180 kDa。免疫组化染色发现：TLR-9阳性表达为黄色，主要分布在肿瘤细胞胞浆内。结论 TLR-9可能通过免疫机制参与喉癌的发展过程。

　　【关键词】 Toll样受体-9;肿瘤;喉

　　Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是存在于哺乳动物且与Toll蛋白同源的分子，是非特异性免疫的重要组成部分，可能参与多种恶性肿瘤的发生、发展过程，其促效剂可作为相关免疫佐剂治疗各种疾病〔1〕。TLR-9能够刺激B细胞和树突状细胞分泌大量的细胞因子和趋化因子，如白介素(IL)-12〔2〕、IL-6、干扰素-γ、单核细胞抑制蛋白和金属基质蛋白酶等的表达〔3〕。很多肿瘤都出现TLR-9高表达现象，而以往的研究对其在喉鳞状细胞癌中的作用很少涉及。本研究旨在探讨TLR-9在喉鳞状细胞癌发病机制中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料 34例喉鳞状细胞癌及相应的癌旁组织30例，其中4例声带癌未取癌旁组织，来源于2003年9月～2007年6月本院手术切除的标本，癌旁组织为取自肿瘤边缘5 mm以外区域，为肉眼下“正常组织”。组织切除后，分成两份，一份立即放入液氮中备用，另一份放入福尔马林中固定后，石蜡包埋标本。全部肿瘤组织经病理诊断均为喉鳞状细胞癌，按国际抗癌协会TNM分期标准，Ⅰ期9例，Ⅱ期16例，Ⅲ期6例(3例T3N0M0，3例T3N1M0)，Ⅳ期3例(均为T4N1M0)，所有肿瘤患者中，男26例，女8例;年龄25～79岁，中位年龄58岁，术前均未经化疗或放疗。

　　1.2 主要试剂和仪器 Trizol(中国鼎国生物公司)，逆转录酶MLV、TaqDNA聚合酶，dNTP(中国宝泰克生物公司)，2700型PCR扩增仪(PE公司)，WD-9403C型紫外分析仪(北京市六一仪器厂)，GIS-2008凝胶图像处理系统(Tanon)。山羊抗人TLR-9多克隆抗体(Santa Cruze )，碱性磷酸酶标记兔抗山羊二抗(中国鼎国生物公司)，PVDF膜(Sigma)，ECL发光试剂盒(Amersham Pharmacia Biochech)。

　　1.3 组织RNA提取、cDNA合成引物设计 取出液氮中存放的组织约100mg放入匀浆器，加入1 ml Trizol匀浆。然后按说明书用氯仿和异丙醇逐步提取RNA，溶于焦炭酸二乙脂(DEPC)水中，用紫外分光光度仪检测定量。按逆转录试剂说明书进行逆转录。引物序列设计参考文献〔4〕，内参β-actin：上游引物：5′-GTGGGGCGCCCAGGCACCT-3′，下游引物：5′-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTG-3′，扩增产物545 bp;TLR-9：上游引物5′-TGGACTTCCTGCTGGAGGTG-3′，下游引物：5′-CTGCGTTTTGTCGAAGACCA-3′，扩增产物328 bp(上海生工合成)。

　　1.4 PCR扩增 以cDNA 为模板，扩增β-actin及TLR-9基因片段。PCR时，目的基因TLR-9和β-actin在同一薄壁离心管中进行扩增，反应体系(25 μl)含cDNA 0.5 μl，10×buffer 缓冲液2.5 μl，Mg2+终浓度为2.0 mmol/L，d NTP的终浓度为0.2 mmol/L,上游和下游引物的终浓度各为0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U。各反应条件为变性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸45 s，共32个循环;72℃延伸5 min终止反应。扩增引物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，紫外线自动凝胶成像系统照相，以目的基因的相对分光吸光度值记录结果。

　　1.5 免疫印记 常规方法进行组织蛋白提取，考马斯亮蓝法测蛋白浓度。15 μl蛋白电泳上样，6%积层胶，15% 分离胶，90 mV电泳。20%甲醇转膜缓冲液，30 V转膜过夜。洗膜，一抗1∶50稀释，封闭2 h，TBST洗膜。二抗1∶2 000稀释，封闭1.5 h，ECL试剂盒显色，X线胶片曝光显影。洗脱膜上的一抗、二抗后，GAPDH作为一抗封闭显色，紫外线自动凝胶成像系统照相，以目的蛋白与GAPDH蛋白比值作为相对分光吸光度值记录结果。

　　1.6 免疫组化 石蜡标本连续5 μm切片，脱蜡，水化，3%H2O2室温10 min，抗原修复(枸橼酸抗原修复缓冲液)，PBS洗片，血清封闭，一抗过夜，生物素标记的二抗工作液封闭，新鲜配制的DAB染液显色，自来水洗，终止反应，苏木素复染细胞核，盐酸酒精分化，氨水返蓝。梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片，显微镜下观察。

　　1.7 统计学分析 应用SPSS11.0软件进行统计学分析。

　　2 结果

　　2.1 RT-PCR检测结果 TLR-9 mRNA在喉癌及喉正常组织内均有表达。TLR-9在喉癌组织中的表达较癌旁正常组织表达明显增多(t=2.743,P=0.017)，并且在喉癌组织Ⅰ期+Ⅱ期与Ⅲ期+Ⅳ期表达之间差异具有统计学意义(t=1.787,P=0.040)(表1、2及图1)。

　　表1 喉癌组织和癌旁正常组织中TLR-9 mRNA的表达(略)

　　表2 喉癌组织Ⅰ期+Ⅱ期与Ⅲ期+Ⅳ期TLR-9 mRNA的表达(略)

　　表3 喉癌组织Ⅰ期+Ⅱ期与Ⅲ期+Ⅳ期TLR-9表达(略)

　　M:DL2000 DNA marker，1:Ⅰ期喉癌组织，2：Ⅱ期喉癌组织，3、4：癌旁正常组织，5：Ⅲ期喉癌组织，6：Ⅳ期喉癌组织

　　图1 TLR-9 mRNA电泳结果(略)

　　1：癌旁正常组织，2～4：喉癌组织

　　图2 TLR-9蛋白质免疫印迹结果(略)

　　2.2 免疫印迹结果 由图2可见，喉癌及癌旁正常组织内均有GAPDH蛋白的表达，蛋白条带位置为36 kDa，TLR-9的表达位置在180 kDa，癌旁正常组织检测不到TLR-9表达。喉癌组织Ⅰ期+Ⅱ期与Ⅲ期+Ⅳ期TLR-9表达差异具有统计学意义(t=1.701,P=0.015)(表3)。

　　2.3 免疫组化染色结果 所有切片染色背景清晰，TLR-9阳性反应呈黄色，阴性对照不着色。TLR-9主要存在于肿瘤细胞胞浆内，在癌旁正常鳞状上皮内不表达(图3)。

　　图3 TLR-9免疫组化染色结果(略)

　　3 讨论

　　目前认为，肿瘤细胞的免疫活性使肿瘤能够逃避机体免疫系统的识别，是肿瘤发展过程中的重要因素。TLRs是哺乳动物体内的天然免疫分子,属于模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR),在识别和抵御各种病原微生物感染中发挥着重要作用。其中，TLR-9是典型的Toll家族成员，细菌和病毒DNA中的CpG基序或人工合成的寡脱氧核苷酸(CpG-oligodeoxynucleotides，CpG-ODN)是TLR-9目前唯一明确识别的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)〔5〕。某些实体瘤和血液系统肿瘤都可检测到TLR-9的表达异常〔6〕。

　　本研究对肿瘤组织内的TLR-9在基因水平和蛋白水平都作了检测，并和癌旁正常组织进行对比，结果发现癌组织的表达都比癌旁正常组织明显增高，并且这种改变与临床分期呈正相关。在免疫组化染色图片上，发现TLR-9主要在喉癌的胞浆细胞中表达。这和Schmausser〔7〕等发现TLR-4、TLR-5和TLR-9共同参与胃癌发生的研究结果一致。Platz〔8〕等也发现TLR-9在呼吸道上皮细胞上表达，并与血管源性趋化因子IL-8的上调有关，且上调的IL-8可促进肿瘤的生长。

　　TLR-9识别内、外源性配体后，启动炎性应答信号通路，如CpG-DNA可进入树突细胞，在溶酶体区域与TLR-9特异性作用，然后通过MAPK、核因子-κB(NF-κB)途径及衔接子MyD88激活下游信号通路〔9〕，最终导致类浆细胞树突细胞的活化并成熟为专职抗原提呈细胞。这些成熟的抗原提呈细胞表面表达共刺激分子(CD80、CD86)、趋化因子受体CCR7〔10〕，分泌Thl型细胞因子，活化NK细胞〔11〕。中性粒细胞表面Fc受体表达增加，细胞毒细胞活性增强，进一步引起更多类浆细胞、树突细胞活化成熟、抗原提呈〔12〕。在Thl型细胞因子的环境中，即使没有CD4+T细胞的辅助，也能够诱导特异性CD8+T细胞应答〔13〕，并通过上调主要组织相容性复合物(MHC)和CD80、CD86等共刺激分子表达，分泌TNF-α、IL-6等细胞因子而对机体组织产生保护或损伤作用〔14〕。而目前CpG-ODN作为免疫佐剂在A549细胞上通过TLR-9诱导强的Thl型免疫应答〔15〕，可能作为单一治疗或者免疫治疗的辅助治疗应用于肿瘤的治疗〔16〕。

　　总之，本研究首次发现：TLR-9在喉鳞状细胞癌组织中表达量增高，并随临床分期的增加而增加，其机制可能和TLR-9参与肿瘤免疫有关，提示TLR-9可能成为肿瘤治疗的一个新的干预靶点和判断患者预后的一项重要指标，或可应用相应抑制剂及基因静默的方法抑制肿瘤组织内炎性微环境中的恶性循环过程，改变肿瘤的进程。

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