实验性变应性鼻炎豚鼠鼻黏膜中TGF-β1表达及意义

　　作者：雷霏 许晶 徐洪君 董震 作者单位：吉林大学中日联谊医院耳鼻咽喉头颈外科，吉林 长春 130033

　　【摘要】 目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)在变应性鼻炎豚鼠鼻黏膜中的表达和意义。方法 建立豚鼠变应性鼻炎模型，利用免疫荧光法检测TGF-β1，并于激光共聚焦显微镜下观察其在鼻黏膜内分布及表达情况。结果 对照组豚鼠鼻黏膜内，TGF-β1几乎没有表达;变应性鼻炎组豚鼠鼻黏膜内TGF-β1有明显表达，主要分布在黏膜上皮细胞及固有层内浸润的炎细胞胞浆和细胞外基质。结论 TGF-β1可能在变应性鼻炎组织重塑过程中起重要作用。

　　【关键词】 变应性鼻炎;转化生长因子β1

　　国内研究证实，致敏豚鼠在长期抗原刺激下，鼻黏膜形态学会发生组织重塑(RM)〔1〕，而RM过程中一系列病理变化可进一步促进疾病进展,使疾病慢性化、重症化和难治化。转化生长因子β1(TGF-β1)是参与哮喘气道RM的重要因子，本研究旨在探讨TGF-β1是否参与变应性鼻炎鼻黏膜RM过程，为进一步研究变应性鼻炎的发病机制及有效治疗奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组与模型建立〔2〕 健康Hartley系豚鼠30只，雄性，体重300～350g，利用随机数字表随机分为实验组即变应性鼻炎组和对照组，每组15只。变应性鼻炎组豚鼠于第1天，以致敏液(含卵清蛋白10 mg、氢氧化铝凝胶0.5 ml和生理盐水0.5 ml)1 ml腹腔注射，行基础致敏;第8天，再以上述致敏液1 ml腹腔注射，行强化致敏;第22天起，以1%卵清蛋白(OVA)鼻腔激发，每次25 μl/鼻孔，1次/d;待出现典型变应性鼻炎症状后，改为3次/w，共持续12 w，每次滴鼻后观察豚鼠症状。对照组豚鼠始终以生理盐水代替OVA进行实验。

　　1.2 组织学处理 两组豚鼠于最后一次鼻腔内激发24 h后，腹腔注射过量2%戊巴比妥处死，取鼻中隔黏膜，10%甲醛固定，石蜡包埋、切片，行常规HE染色显示嗜酸粒细胞(EOS)，判断模型是否成功。

　　1.3 TGF-β1免疫荧光标记 载玻片经去除自发荧光处理后,常规石蜡切片,切片厚4～6 μm。切片以梯度酒精脱蜡，0.3 %火棉胶覆盖15 min，冷100%酒精逐级洗脱至水。0.1 %蛋白酶室温孵育15 min，冷PBS(pH=7.45)中放置60 min 终止反应。3%H2O2-甲醇阻断液阻断20 min,PBS洗3×5 min。非免疫动物血清室温孵育10 min。加入兔抗TGF-β1多克隆抗体,4℃过夜。PBS洗3×5 min之后，再加入荧光二抗〔TRITC标记的山羊抗兔 IgG(红色)〕，PBS充分洗40 min以上,Hoechest 33342(蓝色)复染细胞核，甘油封片,激光共聚焦显微镜下观察。

　　2 结果

　　2.1 造模结果 变应性鼻炎组豚鼠以1%OVA鼻腔局部激发后，出现典型喷嚏及搔鼻症状，且鼻黏膜内可见EOS大量浸润(图1A)，而对照组无EOS浸润(图1B);提示模型建立成功。

　　图1 两组豚鼠鼻黏膜EOS浸润状况(箭头所示)(HE，×400)(略)

　　2.2 TGF-β1表达 FV1000型激光扫描共聚焦显微镜下可见TGF-β1阳性显示为红色荧光，细胞核显示为蓝色荧光。正常豚鼠鼻黏膜内，TGF-β1几乎没有表达(图2B);变应性鼻炎组豚鼠鼻黏膜内TGF-β1有明显表达，且主要表达在黏膜上皮细胞及固有层内浸润的炎细胞胞浆和细胞外基质(图2A)。

　　图2 两组TGF-β1表达状况(箭头所示)(激光扫描共聚焦显微镜，×1 200)(略)

　　3 讨论

　　RM是近年来提出的一个新概念，是指当组织损伤反复发生时，机体对损伤因子产生不适当的组织反应，而形成对原有组织结构的重新构建，它既包括反复损伤而导致的原有组织结构不能恢复，也包括病理条件下的过度修复形成的组织结构异常〔2〕。变应性鼻炎鼻黏膜RM主要表现为呼吸区黏膜的组织结构改变，其主要特征表现为：黏膜纤毛上皮损伤(包括纤毛脱落和部分上皮细胞剥脱);杯状细胞增生以及细胞外基质沉积等〔3～5〕。在呼吸道，反复发作的慢性炎症造成黏膜组织损伤和炎症状态下的组织修复反复进行，从而导致黏膜的RM。

　　TGF-β1是一个多功能细胞因子，既是促炎因子，也是生长因子，其最显著的生物学作用是促进细胞外基质的产生。该作用通过以下途径实现：刺激细胞外基质蛋白质合成，抑制蛋白酶合成，刺激蛋白酶抑制剂合成，增加细胞表面与细胞外基质蛋白质相结合的膜蛋白形成〔6〕。TGF-β1主要由受损的上皮细胞分泌，可以抑制上皮细胞的修复过程〔7〕，并且是促进纤维化的主要细胞因子，它可以刺激纤维母细胞合成和分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原等，并能促进纤维母细胞向合成胶原能力更强的肌纤维母细胞转化〔8，9〕。

　　本研究发现，长期变应原刺激下，变应性鼻炎模型组豚鼠鼻黏膜上TGF-β1有明显表达，且主要表达在黏膜上皮细胞及固有层内浸润的炎细胞胞浆和细胞外基质;而正常豚鼠鼻黏膜内，TGF-β1几乎没有表达。因此，在长期变应原刺激下，TGF-β1可能是参与变应性鼻炎组织重塑过程的重要因子。这一发现为深入认识变应性鼻炎的本质及选择适当的治疗时机提供了新的依据。它提示早期药物干预避免鼻黏膜向RM方向转变对变应性鼻炎的治疗至关重要，这些都将为变应性鼻炎治疗策略的完善提出新的挑战。

　　【参考文献】

　　1 Rivera J，Gilfillan AM.Molecular regulation of mast cell activation〔J〕.J Allergy Clin Immunol,2006;117(6):1214-25.

　　2 佘文煜,董 震.实验性变应性鼻炎鼻黏膜组织重塑的特点〔J〕.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2006;1:48-53.

　　3 Agha-Mir-Salim P，Rauhut O，Merker HJ.Electron and fluorescence microscopic investigations on composition and structure of the epithelial basement membrane of the human inferior nasal concha〔J〕.Eur Arch Otorhinolaryngol,1993;250(7):401-7.

　　4 Gluck U，Gebbers J.Epithelial changes in seasonal allergic rhinitis throughout the year:evidence of coexistent air pollution and local secretory IgA deficiency〔J〕.ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec，2000;62(1):68-75.

　　5 Lim MC，Taylor RM，Naclerio RM.The histology of allergic rhinitis and its comparison to cellular changes in nasal lavage〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，1995;151:136-44.

　　6 Sanai A，Nagata H，Konno A.Extensive interstitial collagen deposition on the basement membrane zone in allergic nasal mucosa〔J〕.Acta Otolaryngol，1999;119(4):473-8.

　　7 Barnard JA，Lyons RM，Moses HL.The cell biology of transforming growth factor beta〔J〕.Biochim Biophys Acta,1990;1032:79-87.

　　8 Vignola AM，Chanez P，Chiappara G,et al.Transforming growth factor-beta expression in mucosal biopsies in asthma and chronic bronchitis〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，1997;156:591-9.

　　9 Puddicombe SM，Polosa R，Richter A,et al.Involvement of the epidermal growth factor receptor in epithelial repair in asthma〔J〕.FASEB J，2000;14:1362-74.