榄香烯乳对大鼠脑缺血模型纹状体内TNFα、IL-1β和NO的影响

　　作者：李伟 吕传真 作者单位：山东大学齐鲁医院神经内科，山东 济南 250012

　　【摘要】 目的 研究榄香烯乳对脑缺血区纹状体内TNFα、IL-1β、NO的影响。方法 通过逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测TNFα、IL-1βmRNA表达的变化，以ELISA方法测定IL-1β、TNFα含量，以微透析技术检测缺血部位细胞外液中NO代谢产物亚硝酸盐的含量。结果 榄香烯乳对脑缺血后纹状体内NO-2、IL-1β及TNFα、IL-1βmRNA的表达没有影响，与生理盐水组〔(12.68±1.39)μg/g蛋白〕相比，给予10 mg/kg的榄香烯乳〔(7.79±1.24)μg/g蛋白〕可以降低缺血侧纹状体内TNFα的水平。结论 脑缺血后给予适宜的小剂量榄香烯乳可降低缺血侧纹状体内TNFα水平，可能对缺血损伤产生一定的保护作用。

　　【关键词】 脑缺血;一氧化氮;TNFα;IL-1β;榄香烯

　　近年研究资料表明，炎症介质参与了脑缺血损伤，细胞因子是炎症反应的主要介质，包括肿瘤细胞坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-1β(IL-1β)等。一氧化氮(NO)是一种具有多种生物活性的物质，在脑缺血后，损伤区内发生明显的炎症反应和白细胞入侵，产生大量的NO，使损害进一步加重〔1〕。而抑制缺血后的炎症反应可对脑缺血产生保护作用。莪术为姜科植物的根茎，功能是行气破血、消积止痛。榄香烯是其挥发油中的一种成分，为我国自行研制的抗癌新药。目前使用其乳化剂做静脉注射，它对体内外肿瘤生长有很好的抑制作用，并有改善微循环的功效〔2～4〕，但其在缺血性脑卒中的应用机制尚不完全清楚，本文利用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血模型，研究局灶性脑缺血后缺血区纹状体内TNFα、IL-1β、NO的变化，观察榄香烯乳对脑缺血损伤的影响并对其机制作初步探讨。希望能为缺血性脑卒中的治疗提供新的途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 Sprague-Dawley 大鼠，雄性，体重250～300 g,购自中科院实验动物中心，实验分40、20、10、5 mg/kg榄香烯乳组及生理盐水组(各组n=6)(检测IL-1β和NO时只有生理盐水组、40、10 mg/kg榄香烯乳组)。

　　1.2 手术及给药方法 采用 Longa法〔5〕制备大鼠局灶性脑缺血模型，用电热毯和电灯保温,手术中维持动物肛温37～37.5℃。在插线成功后，经股静脉注射药物。

　　1.3 取材及提取RNA 缺血1 h再灌注3 h断头取脑，在冰浴中快速分离出纹状体，放入液氮速冻，-80℃冻存。提取RNA并进行RNA定性及定量。引物序列及扩增片段长度β-actin P1 5′CCTCTATGCCAACACAGTGC 3′，P2 5′GTACTCCTGCTTGCTGATCC 3′，扩增片段211 bp。TNFα P1 5′TACTCCCAGGTTCTCTTCAAG 3′，P2 5′ACGATAAAGGGGTCAGAGTA 3′，扩增片段376 bp;IL-1β P1 5′ CTCTGTGACTCGTGGGATGATGAC 3′，P2 5′CTCTGTGACTCGTGGGATGATGAC 3′，扩增片段396 bp。RT-PCR步骤按试剂盒说明。取产物15 μl用2.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，并用图像仪分析拍照。通过β-actin校正半定量，计算mRNA的相对含量。

　　1.4 脑纹状体内IL-1β、 TNFα含量的测定 缺血1 h再灌注6 h断头取脑，留取标本，-80℃保存。冰浴快速匀浆提取蛋白质，-20℃保存。以改良的Lowry法测定蛋白，ELISA法(试剂盒购自ENDOGEN 公司) 测定IL-1β、TNFα含量 。

　　1.5 脑纹状体内NO含量的测定 将动物固定在立体定向仪，插入微透析探头，缺血前收集一管，再灌注6 h前后10 min收集一管。样品放-80℃冰箱待测。术后确认探头位置。

　　1.6 NO的测定 由于NO的半衰期极短，其定量非常困难，故本实验以微透析技术检测缺血部位细胞外液中其代谢产物亚硝酸盐的含量。在酸性环境下，NO-2与对氨基苯磺酸起加成反应，其加合产物与N-(1-萘基)-乙二胺发生反应(Griess 重氮化反应)，将样品或标准品与Griess试剂1∶1混合，反应15 min，用酶标仪在548 nm处测定吸光度。

　　1.7 统计学方法 结果按x±s表示，采用SPSS10.0软件包进行两组间t检验。

　　2 结果

　　2.1 榄香烯乳对脑缺血组织内的TNFα及TNFαmRNA的影响 与生理盐水组相比，榄香烯乳对脑缺血组织内TNFαmRNA的表达没有影响，只有给予10 mg/kg的榄香烯乳可以降低缺血侧纹状体内TNFα的水平(P<0.05)，见表1。

　　2.2 榄香烯乳对脑缺血组织内的IL-1β、IL-1βmRNA及纹状体NO含量的影响 与生理盐水组相比，榄香烯乳对脑缺血组织内IL-1β及IL-1βmRNA和纹状体内NO含量的产生均没有影响，见表2和表3。

　　表1 榄香烯乳对脑缺血组织TNFα mRNA表达相对量(%)及TNFα含量(μg/g蛋白)的影响(略)

　　与生理盐水组相比较：1)P<0.05

　　表2 榄香烯乳对脑缺血组织IL-1βmRNA表达相对量(%)及IL-1β含量(μg/g蛋白)的影响(略)

　　表3 榄香烯乳对脑缺血后纹状体内NO含量(mmol/L)的影响(略)

　　3 讨论

　　脑缺血后发生的病理生理过程极为复杂，涉及多种影响因素。氧自由基和其他信使激活内皮细胞和胶质细胞等，产生炎症反应，释放细胞因子、黏附分子，吸引白细胞贴壁并进入脑实质，炎症本身也产生大量的自由基，形成恶性循环。氧自由基可损伤DNA，进而和其他机制最终导致细胞凋亡。由以上病理过程中可以发现，切断其中的一个环节，有可能阻止损伤的进一步发展，从而对脑缺血产生保护作用。在脑缺血损伤后早期即有IL-1β、TNFα的表达，且与病情严重程度呈正相关〔6〕。我们的试验也证实在缺血1 h后再灌注1 h，在缺血侧纹状体内TNFα即有显著升高，再灌注6 h升高达高峰。由于细胞因子的大量产生，可以刺激黏附分子的表达和生成，吸引白细胞贴壁、聚集，释放血管介质，氧自由基，损伤内皮细胞膜及基底膜，改变血脑屏障的通透性，有助于脑缺血后水肿的形成〔7〕。

　　榄香烯是从中药姜科植物莪术中提取的抗癌有效成分，有很强的杀灭肿瘤细胞和抑制肿瘤生长的作用。静脉或口服给药后均有部分药物通过血脑屏障进入脑组织〔8〕。榄香烯乳可显著提高肿瘤患者血清中SOD活性，通过SOD防御系统，抑制肿瘤生长，清除自由基对机体的损伤〔9〕。榄香烯乳(50～100 mg)可使脑梗死患者的脑电地形图、听觉诱发电位等生理指标改善，改变红细胞比容、红细胞沉积率，降低纤维蛋白原，对周围血管病及冠心病也有很好的疗效。本实验表明缺血后给予小剂量(10 mg/kg)的榄香烯乳对缺血区TNFα、IL-1βmRNA没有影响，但可使缺血区TNFα水平下降，减轻了对缺血区的损害，但其对脑缺血后NO的产生未见影响，而大剂量的榄香烯乳对脑缺血损伤没有作用。有报道榄香烯乳可抑制肿瘤细胞的DNA和RNA及蛋白的合成〔10〕。适宜的小剂量榄香烯乳可降低脑缺血区TNFα的含量，其机制不清，推测可能是其干扰了TNFα转录后的过程。另外,榄香烯乳可以通过前列腺环素的合成，减少血栓素A2(TXA2)生成，而抑制血小板聚集，并可降低全血黏度，从而改善血液循环〔4〕，这可能是其改善神经元损害、内皮细胞肿胀的另外一个原因。

　　因此，在脑缺血后给予适宜的小剂量(10 mg/kg)榄香烯乳可降低缺血侧纹状体内TNFα水平，对缺血损伤可产生一定的保护作用。

　　【参考文献】

　　1 Iadecola C.Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury〔J〕.Trends Neurosci，1997;20:132-9.

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　　8 吴相呈，黄金华，周伟生.榄香烯乳的抑瘤作用及其不良反应的防治〔J〕.中药新药与临床药理，2004;15(1)：70-2.

　　9 许 洪，黎 军，刘 军，等.榄香烯乳对脑肿瘤患者血清SOD活性影响的研究〔J〕.中国肿瘤临床，1996;23(6)：527-9.

　　10 傅乃武，金兰萍， 郭永佃，等.β-榄香烯的抗肿瘤作用和药理研究〔J〕.中药通讯，1984;9(2)：35-7.