胰岛素样生长因子1对大鼠缺血后caspase3和caspase9 mRNA及蛋白表达的影响

　　作者：宋利春 张鸿 刘艳艳 作者单位：中国医科大学附属盛京医院神经内科，辽宁 沈阳 110004

　　【摘要】 目的 探讨胰岛素样生长因子1(IGF1)对大鼠局灶性脑缺血再灌注(I/R)后caspase3和9 mRNA及蛋白表达的影响。方法 30只Wistar雄性大鼠随机分为假手术组、缺血组及IGF1治疗组。应用线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型，应用免疫组化方法检测caspase3及9的蛋白表达，应用RTPCR方法检测caspase3及9 mRNA的表达。结果 IGF1治疗组与缺血组相比，caspase3和9蛋白及mRNA表达显著减少(P<0.01)。结论 IGF1能显著减少脑I/R后caspase3和9蛋白及mRNA 表达，对脑I/R损伤发挥保护作用。

　　【关键词】 脑缺血;胰岛素样生长因子1;caspase3;caspase9

　　胰岛素样生长因子1(IGF1)是一种重要的神经营养因子，在神经组织的生长、分化、修复、再生中具有重要的保护作用〔1〕，近年来研究显示IGF1能显著减轻脑缺血后神经元的缺失，对脑缺血再灌注(I/R)损伤有重要的保护作用〔2〕，但机制尚不完全明确。天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶家族(caspases)是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶，凋亡的最后实施是通过caspases的激活而实现的〔3〕。本研究观察了IGF1对大鼠脑I/R后caspase3 和9蛋白及mRNA表达的影响，以明确IGF1的脑保护作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与分组 选择健康雄性Wistar大鼠30只，体重为250～300 g之间，由中国医科大学实验动物中心提供，随机分为假手术组、缺血组和IGF1治疗组。每组各10只大鼠，一半用于免疫组化检测，另一半用于RTPCR检测。IGF1治疗组在缺血10 min后经尾静脉给予10 μg IGF1，假手术组及缺血组经尾静脉给予等量生理盐水。IGF1购于北京晶美生物工程有限公司。

　　1.2 动物模型 大鼠大脑中动脉缺血模型参考改良Nagasawa线栓法〔4〕。大鼠以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔内注射麻醉，仰卧固定，颈部正中切口，分离并暴露左侧颈总动脉及颈内外动脉，结扎左侧颈总动脉及颈外动脉根部，由颈总动脉近分叉处剪一小口插入尼龙线(长50 mm，直径0.23 mm，18 mm处做标记)，插入长度约(18±0.5)mm时感到有轻微阻力时停止，扎紧并固定插线，缝合皮肤，阻断血流1 h后，拔线实现再灌注。假手术组除不插线外，余步骤同手术组。

　　1.3 样品制备 用于免疫组化检测的大鼠在I/R 24 h后经10%水合氯醛深度麻醉(600 mg/kg)，迅速打开胸腔，暴露心脏，剪开右心房，于心尖部剪开左心室，插管至主动脉，快速注入100 ml生理盐水冲洗后，再以4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑，以4%多聚甲醛固定24 h。常规脱水、透明、石蜡包埋、连续冠状切片，切片厚度6 μm,用于免疫组化染色。用于RTPCR检测的大鼠在I/R 24 h后快速断头取脑，取左侧缺血侧大脑半球半暗带区皮质即距离嗅球尖端7～11 mm，矢状裂至外侧裂上1/3的皮质〔5〕。-70℃冰箱保存进行RTPCR检测。

　　1.4 免疫组化检测 切片常规脱蜡至水，滴加3%H2O2室温10 min，蒸馏水洗3 min×3次，微波修复抗原，滴加5%BSA血清封闭液，室温20 min甩去多余液体，滴加一抗(兔抗大鼠caspase3或9 IgG)，37℃孵育120 min，PBS洗2 min×3次，滴加二抗(生物素标记山羊抗兔IgG)，37℃孵育20 min，PBS洗2 min×3次，滴加试剂SABC，37℃反应20 min，PBS洗5 min×4次，DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。胞浆着色呈棕黄色为阳性细胞。caspase3及9免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司。在高倍物镜下，取每张切片中梗死灶边缘区域相互不重叠的4个视野，利用计算机图像分析系统测定其积分光密度值(IOD)。

　　1.5 逆转录聚合酶链反应(RTPCR) 按常规方法提取RNA。PCR扩增反应：引物序列分别为caspase3：上游正义引物：5′CTGGACTGCGGTATTGAG3′(GenBank NM012922)，下游反义引物：5′GGGTGCGGTAGAGTAAGC3′(GenBank NM012922)，扩增产物片段长度102 bp;caspase9：上游正义引物：5′CCAGATGCTGTCCCATACC3′(GenBank NM031632)，下游反义引物：5′ATTGGCGACCCTGAGAAG3′(GenBank NM031632)，扩增产物片段长度228 bp;内参照βactin 引物序列：上游正义引物：5′CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC3′，下游反义引物：5′CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG3′,扩增产物片段为690 bp。PCR反应体系：双蒸水17.1 μl，cDNA 3 μl，10×缓冲液2.5 μl,dNTPs(2.5 mm)2 μl,TaqE(5 U/μl)0.2 μl，caspase3、9、βactin上下游引物各0.1 μl。反应条件：94℃ 40 s变性，51.5℃ 1 min退火，72℃ 1 min延伸，32次循环，72℃ 7 min终止。扩增产物用2%琼脂糖凝胶，TBE电泳缓冲液电泳。RTPCR试剂盒购于大连宝生物技术有限公司。应用1D Kodak成像分析系统对电泳条带进行吸光度(A)值的半定量分析，结果以caspase3、9、mRNA产物的A值Ac与同一样本βactin产物的A值Aβ比值(Ac/Aβ)来表示。

　　1.6 统计学方法 数据以x±s表示，组间比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 各组caspase3及9蛋白表达的变化 假手术组仅见少量caspase3及9蛋白表达，缺血组及IGF1治疗组caspase3、9蛋白表达较假手术组显著升高(P<0.01)，阳性细胞主要分布在缺血半暗带内，IGF1治疗组caspase3及9蛋白表达较缺血组均显著下降(P<0.01)。见表1及图1。

　　2.2 各组caspase3及9 mRNA表达的变化 假手术组caspase3和9 mRNA仅见微弱表达，缺血组和IGF1治疗组caspase3及9 mRNA的表达较假手术组显著增多(P<0.01)，IGF1治疗组caspase3及9 mRNA的表达与缺血组比较显著下降(P<0.01)。见表1及图2、图3。

　　表1 各组caspase3和9 mRNA及蛋白表达的比较(略)

　　与假手术组比较：1)P<0.01;与缺血组比较：2)P<0.01

　　图1 各组脑缺血再灌注后caspase3及9蛋白表达的比较(免疫组化，×400)(略)

　　图2 各组脑I/R后caspase3 mRNA的比较(略)

　　图3 各组脑I/R后caspase9 mRNA的比较(略)

　　3 讨论

　　目前认为caspases家族是一大类凋亡调控基因，迄今为止这一家族至少有14个成员，其中caspase9、3是细胞凋亡线粒体通路中最重要的蛋白酶〔6〕。线粒体通路是指氧自由基、钙超载等凋亡刺激因素使线粒体通透性增加，线粒体跨膜电位(△ψm)下降，释放细胞色素C(CytoC)，CytoC主要激活caspase9进而也激活下游的caspase3，诱导细胞凋亡〔7〕。我们的实验证实了缺血组caspase9、3 mRNA及蛋白表达明显增高，提示线粒体通路参与了脑I/R后神经元凋亡的调控。

　　IGF1是由70个氨基酸构成的单链多肽，分子量是7 649，和胰岛素原有50%的序列相同。基因编码在12号染色体上，由6个外显子和多个内含子构成。Schwab等发现急性脑梗死病人血浆IGF1和IGF1结合蛋白3 (IGF1BP3)水平下降，而且下降程度及梗死灶大小呈正相关〔8〕。我们的前期研究发现外源性给予IGF1能显著减少鼠脑I/R后脑梗死的体积，减少神经元凋亡〔9〕。本实验结果显示IGF1能显著减少脑I/R后caspase3、9 mRNA及蛋白的表达，这提示IGF1可能通过抑制线粒体途径，来减少脑缺血后神经元凋亡，对脑I/R损伤发挥保护作用。IGF1有可能作为一种有潜力神经保护剂在临床用于脑缺血的治疗。

　　【参考文献】

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　　3 Faubel S，Edelstein CL.Caspases as drug targets in ischemic organ injury〔J〕.Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord,2005;5(3):26987.

　　4 Nagasawa H，Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion〔J〕. Stroke,1989;20(8):103743.

　　5 Shi J，Yang SH，Stubley L,et al.Hypoperfusion induces overexpression of βamyloid precursor protein mRNA in a focal ischemic rodent model〔J〕. Brain Research，2000;853(1):14.

　　6 袁长青，丁振华.Caspase 的活化及其在细胞凋亡中的作用〔J〕.生理学进展，2002;33(3)：2204.

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　　8 Schwab S，Spranger M，Krempien S,et al.Plasma insulinlike growth factor1 and IGF binding protein 3 levels in patients with acute cerebral ischemic injury 〔J〕.Stroke,1997;28(9):17448.

　　9 张 鸿，郑东明，赵冬雪，等.胰岛素样生长因子1对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及 Bcl2,Bax蛋白表达的影响〔J〕.中国现代医学杂志,2004;14(18):148.