子宫内缺氧对子代大鼠老年期脑白质MBP、NF-H+L表达的影响

　　作者：王凌星 蔡若蔚 吕国荣 作者单位：福建医科大学附属第二医院神经内科，福建 泉州 362000

　　【摘要】 目的 探讨子宫内缺氧对子代大鼠老年期脑白质髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)、神经微丝H+L(neurofilament-H+L，NF-H+L)表达的影响。方法 建立SD大鼠宫内缺氧模型，免疫组化检测子代大鼠老年期脑室旁白质MBP、NF-H+L表达并行图像分析;电镜下观察子代大鼠脑内髓鞘、轴突、微血管的超微结构。结果 宫内缺氧的主效应可使子代大鼠老年期脑白质的MBP、NF-H+L表达减少(均P<0.05)，MBP与NF-H+L呈高度正相关(R2=0.64，P<0.01)。电镜观察，与空白对照组相比，宫内缺氧组子代大鼠老年期脑内可见较多的髓鞘脱失、轴突受损、微血管病变。结论 宫内缺氧可影响子代大鼠老年期脑白质MBP、NF-H+L表达，出现髓鞘脱失、轴突受损。

　　【关键词】 宫内缺氧;老年期;髓鞘碱性蛋白;神经微丝H+L

　　基金项目：福建医科大学科研发展基金项目(FJGXY04023)

　　1993年Barker等〔1〕提出成年疾病的胎儿起源假说，认为妊娠期胎儿营养不良会导致代谢、生理和结构参数的持久改变，引起生命后期的疾病发生。此后的研究表明围生期不利营养因素与成年心血管疾病、高血压、2型糖尿病和脑血管疾病相关，这些不利因素包括母亲的营养缺乏、情绪压力和胎儿缺氧等〔2〕。随着影像学技术的广泛应用，脑白质病变，如白质疏松的诊断率越来越高，而且白质病变与卒中、痴呆相关〔3〕，其重要性受到越来越广泛关注。本研究旨在观察宫内缺氧对子代大鼠老年期脑白质髓鞘及轴突的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 SD孕鼠60只由福建医科大学实验动物中心提供;75 cm×65 cm×35 cm的缺氧箱一个;S-450型氧气检测报警仪一台(IST-ATM公司生产);OlympusBH-2照相显微镜(福建医科大学解剖教研室提供);Motic图像分析仪(福建医科大学解剖教研室提供);飞利浦EM208型透射电镜(福建医科大学电镜室提供);MBP 抗体及NF-H 抗体(均由美国Dako公司提供);KIT-5001及 KIT-5004即用型快速免疫组化MaxVisionTM 检测试剂盒(均购自福州迈新生物技术开发公司);医用压缩氧气(浓度>99%)，压缩氮气(浓度>99%)(由泉州制氧厂提供)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 根据Jonathan等〔4〕的方法建立宫内缺氧模型 将孕龄15 d的SD孕鼠共30只，分批置入缺氧箱中，箱内氧浓度由监测仪监测，实时调节氧气与氮气流量，将箱内氧气浓度控制在9%～9.5%之间，每日间断缺氧1 h，直至分娩。将30只孕龄相同的孕鼠分批置于另一玻璃箱内(对照组)，持续通入空气，置于箱内的时间同缺氧组。缺氧1 h后，实验组和对照组孕鼠麻醉后，取脐血行血气分析。

　　1.2.2 子代鼠筛选 实验组及对照组孕鼠分娩后对子代SD大鼠进行筛选，入选大鼠为：足日出生(孕21 d)，雌雄各半,出生体重5～6 g，生长过程中仔鼠体重平均日增重及各生理学特性均在正常范围。至60 d时，雄性大鼠体重>300 g，雌性大鼠体重>250 g。按“随机数字表法”选取实验组仔鼠24只，对照组24只，雌雄各半，完全随机分组(随机数字表法)(表1)。

　　表1 三因素两水平正交设计表(略)

　　“+”为追加缺氧;“-”为未追加缺氧

　　1.2.3 子代鼠处置 常规条件下饲养子代SD大鼠至12月龄，按实验设计给予高脂饮食(组成：92.3%基础饲料，2%胆固醇，5%猪油，0.5%胆酸钠，0.2%丙基硫氧嘧啶)喂养至15月龄。子代大鼠至12月龄时行慢性间断性缺氧 根据彭斌等〔5〕的缺氧方法设置缺氧条件，每次将8～12只SD大鼠放入缺氧箱中，箱内氧浓度控制在(10±0.5)%。缺氧时间为8 h/d，6 d/w，共持续4 w。参考夏春林等〔6〕方法处死实验动物，采集标本：行腹腔注射麻醉后，灌注固定、取脑，切取0.4 cm×0.2 cm×0.2 cm组织固定于电镜液。余放入4%多聚甲醛溶液固定，脱水包埋，取经脑室平面切片备用。

　　1.2.4 免疫组化方法 链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法)行免疫组化染色及图像分析：石蜡切片脱脂、水化后，PBS冲洗，加鼠组织非特异抗原封闭剂、过氧化物酶阻断溶液、鼠组织抗原阻断剂后，PBS冲洗加所选一抗，室温下孵育60 min，PBS冲洗，加酶标二抗，室温下孵育15 min，PBS冲洗，DAB显色，阳性染色为棕黄色或棕黑色，苏木素复染，PBS返蓝，自来水稍冲冼，梯度酒精脱水干燥，中性树胶封片。对照组用PBS代替一抗做阴性对照。取髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经微丝(NF-H+L)免疫组化染色切片，在同一强度下、放大400 倍随机选取脑室旁白质各 5个视野，测量 MBP、NF-H+L染色阳性信号的累积光密度(IOD)，取其均数作为统计分析数据。

　　1.2.5 电镜下观察髓鞘、轴突、脑微血管超微结构 3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾后固定，酒精-丙酮脱水，环氧树脂618包埋剂包埋;超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，透射电镜观察、摄影。

　　1.3 统计学处理 实验数据以x±s表示，SPSS11.0软件进行统计学处理。分析前均行正态性检验和方差齐性检验。

　　2 结果

　　2.1 孕鼠脐血血气分析 孕鼠缺氧1 h后pH值、SaO2下降，PaCO2升高，PaO2明显下降，实验组与对照组孕鼠脐血的pH值、PaCO2、PaO2、SaO2差异显著，提示建模成功(表2)。

　　表2 孕鼠脐血血气分析均值(略)

　　与对照组比较：1)P<0.05

　　2.2 子代大鼠老年期脑室旁白质MBP、NF-H+L的变化 MBP主要表达于脑室旁白质的髓鞘，呈棕黄色。在对照组，可见突起呈条索状，较长且连续，形状细直，排列规整。在实验组，白质MBP表达出现断裂、不连续，或弯曲变形，排列尚可。在宫内缺氧+追加缺氧+高脂饮食组，白质MBP表达进一步减少，呈点、碎屑状分布，排列极其紊乱。NF-H+L表达于脑室旁白质的神经纤维内，呈棕黄色。在对照组，可见突起呈长丝状，形状细直，排列规整。在实验组，白质NF-H+L的长丝状表达出现断裂，部分弯曲，排列尚可(图1)。在宫内缺氧+追加缺氧+高脂饮食组，白质NF-H+L表达进一步减少，断裂呈线头状分布，明显变形，排列紊乱。

　　2.3 子代大鼠老年期脑室旁白质MBP、NF-H+L的表达 见表3。宫内缺氧、追加缺氧、高脂饮食三因素均使子代大鼠脑白质的MBP、NF-H+L表达减少，其中宫内缺氧与高脂饮食、宫内缺氧与追加缺氧、高脂饮食与追加缺氧间存在一阶交互作用(均P<0.05)，宫内缺氧、高脂饮食与追加缺氧三因素间存在二阶交互作用(P<0.05)，导致白质MBP、NF-H+L表达进一步减少。子代大鼠老年期脑室旁白质MBP和NF-H+L累积光密度的相关性分析：子代大鼠脑室旁白质MBP与NF-H+L累积光密度呈高度正相关，r=0.837，R2=0.64，P<0.01(图2)。

　　2.4 超微结构观察 每份标本随机选取五个视野进行观察，对照组子代大鼠老年期脑内神经髓鞘呈明暗相间的同心圆板层结构(图3A);轴突表面光滑连续，轴突内可见微丝，线粒体结构完整(图3A);血管内膜光滑无增厚，管腔完整(图4A)。实验组可见：①髓鞘脱失：内层或外层局灶性板层松解使髓鞘呈链状剥脱、断裂、变厚(图3B)。②轴突受损：部分肿胀、粗细不均或弯曲，轴突内线粒体变性，神经微丝增多积聚(图3B)。③脑微血管病变：血管内皮细胞变性，内膜增厚，管腔狭窄(图4B)。

　　表3 子代大鼠脑室旁白质区MBP、NF-H+L阳性信号的累积光密度情况(略)

　　与空白对照组比较：1)P<0.05

　　表4 宫内缺氧、追加缺氧、高脂饮食对子代大鼠老年期脑室旁白质MBP、NF-H+L累积光密度的影响(略)

　　图1 MBP及NF-H+L免疫组化表达(DAB染色，×400)(略)

　　图2 MBP和NF-H+L累积光密度(IOD)的分布情况(略)

　　图3 脑内神经髓鞘及轴突(铀铅双染色)(略)

　　图4 脑内微血管(铀铅双染色)(略)

　　3 讨论

　　脑白质主要由神经轴索构成，主要成分是髓鞘、轴突和神经胶质〔7〕。轴突为髓鞘所包盖，髓鞘对神经元轴突具有“屏蔽”作用，可以防止神经纤维在传导冲动时的相互干扰，以保证其传导的精确性。构成髓鞘的蛋白质中MBP约占总量的1/3〔7〕。NF是轴突骨架结构的重要组成部分,由低分子量(NF-L，68 kD)、中分子量(NF-M，160 kD)和高分子量 (NF-H，200 kD)三种多肽亚单位组成，NF-L跟NF-M 或NF-H一起组成一种特定的二聚体〔8〕。我们用 MBP、NF-H+L分别代表白质中髓鞘、轴突的受损情况。

　　实验中对照组子代大鼠脑白质MBP、NF-H+L表达长且连续，排列规整，超微结构示髓鞘呈明暗相间的同心圆板层结构，轴突表面光滑连续，说明髓鞘发育正常。宫内缺氧的主效应使子代大鼠老年期脑白质的MBP、NF-H+L出现断裂、表达减少，说明宫内缺氧会导致持久有害的影响，引起老年期脑白质的髓鞘和轴突损害。而超微结构观察进一步证实了宫内缺氧组脑白质存在髓鞘脱失、轴突受损。宫内缺氧与高脂饮食、宫内缺氧与追加缺氧的一阶交互作用，宫内缺氧、高脂饮食与追加缺氧间的二阶交互作用均可增加这种改变。Barker〔1〕认为成年疾病的发生与胎儿期宫内条件不良关系密切，与后天的环境因素同样密不可分。敏感、关键发育阶段的刺激或损伤产生长期影响，且这种影响可以被许多后天的环境因素放大，从而增强和加速成人疾病的进展过程〔9〕。本实验的结果也证实了后天不利环境(追加缺氧和/或高脂饮食)会加重宫内缺氧对子代大鼠老年期脑白质的影响。

　　已有研究发现〔2〕：慢性宫内缺氧时，胎儿心输出量减少，但通过重新分配心输出量，使胎儿保持几乎正常的脑血流量及氧传递。在胎儿这种适应缺氧过程中，脑血流量的维持除了脑血管阻力的适度增加外，还发现有脑动脉及其平滑肌细胞结构及构成的改变，即大脑中动脉除了增加血管壁厚度外，尚有血管平滑肌的增殖，以及血管周围神经支配的增加。另有研究发现宫内缺氧会引起子代大鼠出生后颈动脉对苯肾上腺素收缩功能减退〔10〕。我们的实验观察到宫内缺氧可导致脑微血管病变，推测这种子代血管变化正是宫内缺氧对脑血管的远期影响。

　　脑室壁周围3～10 mm范围是白质区域的“远端供血区”，即动脉供血的分水岭区，特别易受全身或局灶性脑血流降低的损害。脑微血管病变可能导致分水岭区血流量减少，这种减少没有严重到引起局灶梗塞，但却可能影响少突胶质细胞的功能。因为少突胶质细胞的缺血缺氧易损性远远大于构成白质的其他细胞〔11〕，少突胶质细胞的情况直接影响髓鞘的形成，出现MBP表达减少。MBP减少的另一个可能原因是：构成 MBP 蛋白质的水解逐渐增强。已有文献报道缺血缺氧可激活钙依赖蛋白酶〔12〕，另有一项视神经缺氧的研究表明〔7〕，缺氧引发钙异常流入有髓鞘的轴突，激活蛋白质水解酶，破坏了构成 MBP的蛋白，使 MBP 减少。脑微血管病变可能导致分水岭区血流量减少，增强MBP蛋白质水解，导致脑白质髓鞘损害。

　　本实验中子代大鼠脑室旁白质MBP与NF-H+L的相关性分析提示呈高度正相关，这说明髓鞘脱失与轴突损害具有内在的联系。已有报道〔13〕认为髓鞘通过调节神经微丝和其他底物的磷酸代谢直接影响神经轴突的功能;在动物实验〔7〕中也发现慢性脑组织低灌注状态下髓鞘损坏先于轴突，并可能是轴突损伤的原因。因此，髓鞘的改变可能通过同样的机制影响轴突的完整性。另外本实验中宫内缺氧组轴突内线粒体变性，线粒体的这种改变可能导致细胞色素C释放，破坏轴突细胞骨架、细胞器〔12〕，这可能是轴突损伤的另一个原因。

　　宫内缺氧引起脑白质损害的机制尚不完全清楚，我们推测宫内缺氧可能通过影响血管导致脑白质损伤。白质中髓鞘病变是老化的常见特征，参与老化相关疾病的发生，轴突结构变化可能是老化过程中认知功能障碍的重要大原因〔14〕。宫内缺氧可能加重子代大鼠老年期脑的老化，并进而影响认知功能。

　　【参考文献】

　　1 Barker DJ.Fetal origins of coronary heart disease〔J〕.BMJ,1995;311(6998):171-4.

　　2 Longo LD,Pearce WJ.Fetal cerebrovascular acclimatization responses to high-altitude，long-term hypoxia：a model for prenatal programming of adult disease〔J〕?Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2005;288(1):R16-24.

　　3 王薇薇，吴 逊.老年人无症状脑腔隙梗死及白质病变〔J〕.中华老年医学杂志,2005;24(10):794-7.

　　4 Schwartz JE,Kovach A,Meyer J, et al.Brief,intermittent hypoxia restricts fetal growth in sprague-dawley rats〔J〕.Biol Neonate,1998;73(5):313-9.

　　5 彭 斌，李舜伟，谭会兵.慢性间断性缺氧诱导大脑细胞凋亡的研究〔J〕.北京医学,2002;24(5):331-41.

　　6 夏春林,金 涛,魏福堂.细胞凋亡和Alzheimer病的关系〔J〕.苏州医学院学报，2000;20(12)：1104-6.

　　7 Kurumatani T，Kudo T，Ikura Y,et al.White matter changes in the Gerbil brain under chronic cerebral hypoperfusion〔J〕.Stroke,1998;29:1058-62.

　　8 邓秋琼,刘金华.神经微丝与神经病变〔J〕.中国实用眼科杂志,2006;24(7):670-2.

　　9 Gluckman PD,Hanson MA.Developmental origins of disease paradigm：a mechanistic and evolutionary perspective〔J〕.Pediatr Res,2004;56(3):311-7.

　　10 Williams Sj,Campbell ME,McMillen IC,et al.Differential effects of maternal hypoxia or nutrient restriction on carotid and femoral vascular function in neonatal rats〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2005;288(2):360-7.

　　11 Petito CK,Olarte JP,Roberts B,et al.Selective glial vulnerability following transient global ischemia in rat brain〔J〕.J Neuropathol Exp Neurol,1998;57(3):231-8.

　　12 Lipton P.Ischemic cell death in brain neurons〔J〕.Physiol Rev,1999;79(4):1431.

　　13 Martini R.The effect of myelinating Schwann cells on axons〔J〕.Muscle Nerve,2001;24(4):456-66.

　　14 赵士福,成戎川,刘 磊，等.老年大鼠脑白质损害在学习记忆降低中的意义〔J〕.中国老年学杂志,2006;26(5):638-40.