癫痫大鼠海马线粒体COXⅠ和COXⅣ表达的变化

　　作者：王小花 高静 张同霞 赵秀鹤 刘学伍 迟兆富 作者单位：山东大学齐鲁医院神经内科，山东 济南 250012

　　【摘要】 目的 探讨癫痫对大鼠海马线粒体细胞色素氧化酶(COX)的mtDNA和nDNA编码亚基Ⅰ、Ⅳ表达的影响。方法 成年雄性Wistar大鼠随机分为生理盐水对照组、癫痫持续状态(SE)后急性期(3 h)、静止期(7 d)、慢性期(45 d)组和注射匹鲁卡品(PILO)但未出现SE组。免疫组化并荧光实时定量PCR检测海马线粒体COXⅠ、Ⅳ阳性染色及其mRNA的表达。结果 COXⅠ阳性细胞数在SE后3 h明显增加，7 d降到对照组水平，45 d显著降低;COX Ⅳ阳性细胞数SE后3 h稍有增加，但较对照组无显著性差异，7 和45 d时COXⅣ染色变化与对照组相似;注射PILO但未出现SE组COXⅠ、Ⅳ的表达与对照组类似。COXⅠmRNA在SE后3 h表达明显升高(P<0.001)，7 d时降到对照水平，45 d显著降低(P<0.001);COXⅣ mRNA在3 h时表达较对照组升高，但差异无显著性，7 和45 d时下降至对照组水平。注射PILO但无SE组与对照组结果类似。结论 颞叶癫痫海马COX功能紊乱与痫性发作相关，线粒体编码的基因更易受痫性发作的影响。

　　【关键词】 细胞色素氧化酶;癫痫;海马;线粒体

　　基金项目：山东省“十一五”重大攻关计划(2005gg3202069)

　　Changes of expression of mitochondrial cytochrome oxidase subunits Ⅰ and Ⅳ in the hippocampus of pilocarpine-treated rats

　　WANG Xiao-Hua，GAO Jing，ZHANG Tong-Xia,et al.

　　Department of Neurology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，Shandong，China

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of epilepsy on expression of cytochrome oxidase(COX) subnuitsⅠ(COXⅠ) and Ⅳ(COX Ⅳ) encoded by mtDNA and nDNA respectively in rat hippocampus.Methods Male Wistar rats were divided randomly into saline control, acute period(3 h),silent period(7 d),chronic period groups(45 d) after status epilepticus(SE) and group which received pilocarpine (PILO) but did not develop SE.The expressions of COXⅠ and COX Ⅳ in rat hippocampus were detected respectively by immunohistochemical staining and real time quantitative PCR.Results An significant increase in COXⅠ staining was observed in neuronal cell bodies distributed throughout the hippocampus(CA1，CA2，CA3，dentate gyrus) of rats killed 3 h after SE，when compared to the saline-treated group on day 7 after SE，the immunoreactivity was slowly reduced and the immunoreactivity of cell bodies was restricted predominantly to the dentate gyrus，and CA3 regions of the hippocampus.The chronic period (45 d) showed decreased staining with the findings indicating neuronal degeneration such as condensation of cell bodies，vacuolization and rearrangement of pyramidal cell layers in the CA3 of the hippocampus. COXⅠ mRNA showed significantly increased expression in the group at 3 h after SE(P<0.001)when compared with the control group.The silent group presented similar levels of expression of COXⅠ，but the chronic group showed significantly decreased level in respect to the control group(P<0.001).Slightly increased，but not significant expression of COXⅣ was found in acute(3 h) group，then decreased slightly and remained constant during the following days of epilepsy compared with saline-treated animals.Animals that did not respond to PILO in this study showed similar results with that of control group.Conclusions Dysfunction of COX in the hippocampus are associated with prolonged seizure during experimental temporal lobe epilepsy and mitochondria are more vulnerable to epilepsy.

　　【Key words】 Cytochrome oxidase;Epilepsy;Hippocampus;Mitochondria

　　癫痫是临床上最常见的神经系统疾病之一，国内外对其发病机制进行了大量研究〔1〕。以往研究认为，癫痫导致的神经元损伤主要是由兴奋性氨基酸活动过度引起的〔2〕。近年有学者提出，中枢神经系统线粒体功能障碍可导致癫痫发作，癫痫发作亦可引起线粒体损伤〔2，3〕。线粒体是哺乳动物胞质中唯一含有遗传物质的细胞器，线粒体呼吸链中的5个酶复合体均由线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)和核DNA(nuclear DNA，nDNA)编码的蛋白产物共同组成。因此编码呼吸链中酶复合体亚基的mtDNA和nDNA基因的表达对维持线粒体的正常结构和功能十分重要。细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，COX)是线粒体呼吸链末端的限速酶，由mtDNA和nDNA共同编码的13条亚基组成(COXⅠ、Ⅱ和Ⅲ由mtDNA编码，其余由nDNA编码)。既然癫痫与线粒体有互为因果的关系，在癫痫的不同时程中，线粒体在基因水平有何变化，线粒体基因与核基因的表达协同性如何，国内外此领域研究尚无定论。本研究通过观察癫痫状态(status epilepticus，SE)后不同时程大鼠海马线粒体COXⅠ(mtDNA编码)和COXⅣ(nDNA编码)在基因和蛋白水平的表达变化及协同性，初步探讨线粒体在分子水平与癫痫的关系及核、线粒体基因在癫痫中的协同水平。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 DAB免疫组化试剂盒(北京中山生物技术有限公司);LightCycler 2.0实时定量PCR仪(Roche);匹鲁卡品(Sigma);提取RNA和逆转录试剂盒(Promega);SYBR Green荧光染料试剂盒(Takara);山羊抗人COXⅠ(Santa Cruz),小鼠抗牛COXⅣ(Molecular Probe);其余试剂为国产分析纯。

　　1.2 引物设计 引物由上海英骏生物技术有限公司合成，序列如下：GAPDH(内参389 bp)：上游5′TCAACGGCACAGTCAAGG3′，下游5′TGAGCCCTTCCACGATG3′;COXⅠ(295 bp)：上游 5′CACCCGAGCCTACTTTAC3′，下游5′TGGGAATCAGTGGACGAA3′;COX Ⅳ(331 bp)：上游5′ATGGGAGTGTTGTGAAGAGTG3′，下游5′ TCAAAGGTATGAGGGATGG3′。

　　1.3 动物分组与制模 成年雄性Wistar大鼠50只，160～180 g，7～8周龄(山东大学实验动物中心提供)，随机分为5组：对照组，SE后急性期(3 h)、静止期(7 d)、慢性期(45 d)组和注射匹鲁卡品后未出现SE组(PILO组)，每组10只，每组中4只用于免疫组化，6只用于荧光实时定量PCR。向实验组大鼠腹腔注射10%匹鲁卡品350 mg/kg,并于注射匹鲁卡品前30 min腹腔注入东莨宕碱1 mg/kg，以拮抗其外周胆碱能反应。急性期诱发发作后每天逐只观察动物有无自发性发作。对照组注射等量的生理盐水代替匹鲁卡品。

　　1.4 大鼠惊厥分级及SE判断标准 按Racine〔4〕标准判定癫痫发作的程度：1级:动须、咀嚼;2级:节律性点头;3级:一侧前肢阵挛;4级:站立伴双前肢阵挛;5级:4级+跌倒伴全身抽搐。SE判断标准：出现4级以上的发作并保持连续的运动性发作(如面肌抽搐、节律性点头、肢体阵挛)至少30 min，其间不伴有正常的行为(如理毛)。在惊厥发作持续2 h时，腹腔注射地西泮(10 mg/kg)以终止发作。

　　1.5 实验方法

　　1.5.1 COXⅠ、Ⅳ阳性细胞数 各实验组大鼠在SE后相应的时间点(分别为3 h、7 和45 d)，经心脏生理盐水-多聚甲醛灌注取脑，冠状切取视交叉与视乳头间2～5 mm3组织块，制作冰冻切片。将切片用PBS洗3次，甩干，加山羊血清封闭液，加入COXⅠ、Ⅳ一抗1∶100，4℃冰箱过夜，加生物素标记二抗，加标记过氧化物酶的链霉素-亲和素复合物，DAB显色。光学显微镜下观察结果的标准：COX阳性细胞被染成棕黄色。每个时间点每只大鼠随机取3张切片，于高倍(×400)镜下选定海马组织CA1、CA3区，随机取5个视野，计数COX阳性细胞，取均值。

　　1.5.2 检测COXⅠ和COXⅣ mRNA的表达 大鼠在相应时间点断头取脑，迅速分离两侧海马，置-80℃冰箱中冻存，用于RNA提取。按试剂盒说明提取海马组织总RNA并反转录成cDNA，然后进行实时定量PCR反应。荧光定量PCR 20 μl反应体系包括：RNase Free H2O 6.4 μl，上下游引物各0.8 μl (10 μmol)，SYBR Green 10 μl，cDNA标本2 μl。反应体系加入毛细管后使用LightCycler仪器进行PCR扩增。PCR循环参数为：95℃ 预变性10 s;95℃ 0 s，55℃(GAPDH)/58℃(COXⅠ,COXⅣ)10 s，72℃ 15 s,设置温度改变速率均为20℃/s，循环40次;95℃ 0 s，65℃ 30 s，95℃ 0.1℃/s(温度改变速率);40℃ 30 s结束反应。随机选定某管PCR产物，稀释为1～1×106梯度浓度,与样本同时进行PCR，测定并绘制标准曲线。GAPDH、COXⅠ和COXⅣ的拷贝数根据标准曲线由计算机软件自动计算。数据分析：根据目的基因和内参的标准曲线分别计算该样本的绝对定量的拷贝数，相除得到相对值进行比较，即某样本目的基因的拷贝数/某样本内参拷贝数，即目的基因表达值以COXⅠ(或COXⅣ)/GAPDH拷贝数表示。

　　1.6 统计学处理 计量数据以x±s表示，采用SPSS13.0软件行单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 免疫组化结果

　　2.1.1 COX阳性细胞分布 COX阳性细胞被染成棕黄色。在急性期(SE后3 h)，COXⅠ阳性细胞分布于大鼠整个海马结构内(包括CA1、CA2、CA3区,齿状回)较对照组明显增加;静止期，COXⅠ阳性细胞数逐渐下降，主要局限于海马的齿状回和CA3区;慢性期COXⅠ阳性细胞数减少，神经元变性如细胞体浓缩、海马CA3区锥体细胞层空泡化及细胞重排等。COXⅣ阳性细胞在各实验组海马结构内也有显示，SE后3 h阳性细胞染色稍有增加，但较对照组无显著性差异。静止期和慢性期COXⅣ染色变化与对照组相似。注射PILO但未出现SE组COXⅠ、Ⅳ的表达分别与对照组类似(图1)。

　　2.1.2 COX阳性细胞计数 COXⅠ阳性细胞数在急性期较对照组明显增加(P<0.001);静止期逐渐下降，慢性期较对照组明显减少(P<0.001)。COXⅣ阳性细胞数急性期稍有增加但较对照组无差异，静止期和慢性期较对照组无差异。PILO组COXⅠ、Ⅳ阳性细胞数均较对照组无差异(表1)。

　　表1 COXⅠ与COXⅣ阳性细胞计数(略)

　　与对照组比较：1)P<0.001，下表同

　　2.2 SE后大鼠海马COXⅠ与COX Ⅳ mRNA的表达 如表2，COXⅠ mRNA在急性期表达较对照组明显升高(P<0.001)，静止期降到对照水平，慢性期显著降低(P<0.001);COXⅣ mRNA在急性期表达较对照组升高，但差异无显著性，然后逐渐下降，至静止期和慢性期下降至对照组水平。PILO组COXⅠ、Ⅳ的表达与对照组类似。

　　表2 COXⅠ与 COXⅣmRNA的表达值(略)

　　图1 COXⅠ和Ⅳ阳性染色结果(DAB，×200)(略)

　　3 讨论

　　线粒体是真核细胞内的重要细胞器,其基本功能是通过氧化磷酸化以ATP 的形式为细胞提供能量。生化证据提示，脑内大多数ATP 的消耗用于神经元的电活动,故来自线粒体的充足的能量供应对维持神经元的生存和功能具有重要意义。近年研究发现线粒体与癫痫关系密切，线粒体的功能障碍可导致癫痫发作，癫痫发作亦可损伤线粒体，而线粒体损伤后可释放一系列损伤因子，调控神经元的损伤〔5〕。Cock和Kudin等〔6，7〕的研究表明，SE后出现线粒体的氧化磷酸化改变及呼吸链酶复合体的活性降低，提示线粒体的功能失调是SE的结果，并与SE后神经元死亡相关。癫痫动物模型中发现了线粒体结构和功能的损害〔2，3，8〕：呼吸酶活性改变，线粒体嵴肿胀和膜的完整性破坏。线粒体受损后，释放活性氧及与细胞损伤有关的蛋白〔8，9〕，导致神经元继发性损害，引起癫痫复发，SE发作延长。

　　近年来的研究多发现癫痫可损害线粒体的结构和功能〔2，3，8〕，而关于癫痫引起的线粒体相关基因表达变化的研究不多。本研究发现，线粒体编码的COXⅠ和核编码的COXⅣ在SE后不同时程中基因水平的表达是不同步的。COXⅠmRNA在急性期表达显著升高，静止期降至对照水平，而慢性期则显著降低，说明急性痫性发作诱发该亚单位的重新合成，而慢性期长期自发性孤立的发作则不足以诱导该亚单位的重新合成，反而破坏其合成机制。COX Ⅳ mRNA在各时程则无显著性改变。我们的免疫组化结果显示COX Ⅰ阳性细胞数于急性期明显增加，静止期时下降至正常水平，慢性期时较对照组明显减少，COX Ⅳ阳性细胞数在急性期稍有增加，但较对照组无显著性差异，静止期和慢性期COX Ⅳ染色变化与对照组相似，与mRNA的变化相符。本实验还发现，注射PILO后未出现SE的大鼠各项检测指标与对照组无显著性差异，说明SE后不同时程COX亚基的变化是完全由痫性发作引起的。因此我们可以得出下述结论：线粒体基因由于保护和修复机制不完善，对癫痫的敏感度更高，比核基因更易受到损害。既往研究也发现：印防己碱诱导的癫痫大鼠中，线粒体编码的细胞色素b含量显著下降〔10〕;PILO癫痫模型中，mtDNA拷贝数下降了2～3倍〔7〕;mtDNA的突变率很高，当突变达到一定水平时，可影响呼吸链氧化磷酸化的正常进行，若累及中枢神经系统，则导致线粒体脑病，这类疾病通常存在癫痫发作。如线粒体脑肌病伴乳酸血症和卒中样发作(MELAS)与线粒体tRNALeu基因突变相关〔11〕;肌阵挛癫痫合并破碎红纤维(MERRF)与线粒体tRNALys和tRNASer基因突变相关〔11〕。

　　由于长期痫性发作未改变COX Ⅳ的表达，我们可以推断：COXⅠ基因的改变与海马神经元丢失所导致的线粒体含量下降是无关的，可能的机制是活性氧簇机制。癫痫本身会引起自由基生成增多，而线粒体基因的保护机制和修复机制均不完善，更易受到自由基的攻击，自由基介导mtDNA降解成小的片段，使每个线粒体中mtDNA的拷贝数下降〔12〕。既往有学者在Friedreich共济失调〔13〕和肌萎缩侧索硬化中〔14〕发现氧自由基介导的mtDNA的缺失。海人酸诱导的癫痫大鼠海马中，也曾发现DNA氧化损伤的标记物-8-羟基-2-脱氧鸟苷浓度升高〔15〕。已经证实在人类线粒体肌病〔16〕和小鼠模型〔17〕中由于mtDNA缺失导致线粒体功能的严重破坏，线粒体编码的呼吸链亚单位的合成受损。活性氧簇机制可以很好地解释本实验的COXⅠ、Ⅳ表达不同步的现象。

　　综上，本研究表明，癫痫可引起线粒体编码的COXⅠ亚基在基因和蛋白水平的表达改变，而核编码的亚基COX Ⅳ改变不明显，说明癫痫可导致线粒体功能紊乱，线粒体编码的基因更易受痫性发作的影响。线粒体与癫痫之间功能上的联系为减轻SE后脑损伤和神经保护的发展提供了新的展望。

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