针刺百会、大椎对老年性痴呆大鼠认知行为及脑内乙酰胆碱酯酶的影响

　　作者：赵立刚 马莉 程为平 吴茜 郑祖艳 梅晨健 作者单位：黑龙江中医药大学附属第一医院神经内科，黑龙江 哈尔滨 150040

　　【摘要】 目的 探讨针刺百会、大椎对AD大鼠认知行为及脑内乙酰胆碱酯酶(AChE)含量的影响。方法 选用纯系健康雄性Wistar大鼠52只，随机分为假手术组、模型组、针刺组和西药组。采用β-淀粉样蛋白向海马CA1区定向注射制作AD模型。针刺组选用“百会”、“大椎”穴进行治疗。治疗前后检测各组大鼠的穿梭箱实验成绩和脑组织内AChE的含量。结果 针刺模型大鼠的“百会”、“大椎”穴可以明显减少AD大鼠在穿梭箱实验中的电击次数和电击时间(P<0.05)，非常显著降低脑组织内AChE含量(P<0.01)。结论 采用针刺的方法可明显改善AD大鼠的学习记忆能力，并能减少脑内AChE的含量。

　　【关键词】 针刺疗法;痴呆/老年性;认知行为;乙酰胆碱酯酶

　　老年性痴呆，即阿尔茨海默病(AD)是一种以老年斑、神经元纤维缠结为主要病理改变的进行性神经变性疾病〔1〕，其病因及发病机制尚不清楚。迄今尚缺乏疗效肯定的药物治疗方法，目前试用的药物中尚不能改变疾病的进展。同时为了减少各种治疗药物的毒副作用，临床中我们采用针刺的方法治疗本病，取得了较好的疗效。为了进一步探讨针刺治疗AD的机制，本课题采用颅内注射法制作AD模型进行动物实验研究，针刺百会、大椎穴，治疗前后进行多项指标检测，以验证针刺方法的有效性和可行性。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料和设备 选用纯系健康Wistar雄性大鼠52只，18～20月龄，体重(500±20) g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，室内常温下配料喂养，自由饮食水。乙酰胆碱酯酶(AChE)测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。大鼠程控穿梭箱(中国医学科学院药物研究所DCS-2型);脑立体定位仪(NARISHIGE SN-2型);电动离心机(北京医用离心机厂 LD5-2型);电热恒温水浴箱(江苏省金坛市医疗仪器厂RF-540型);电热恒温培养箱(中国厦门医疗电子仪器HWB-2型);电动玻璃匀浆机(宁波新芝科学仪器研究所DY89-1型);分析振荡器(江苏泰县医疗器械厂FZQ-2型);托盘式扭力天平(上海第二天平仪器厂TN-100B型);722光栅分光光度计(上海第二分析仪器厂)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组与模型制备方法 β-淀粉样蛋白(β-AP)每瓶100 μg，注生理盐水20 μl，用封口膜封好，电热恒温培养箱内37℃下孵育1 w。52只Wistar大鼠，随机分成4组：假手术组、模型组、西药组和针刺组，每组13只。其中针刺组、西药组和模型组大鼠，采用颅内注射法〔2〕。其中术前12 h禁食水。以20%乌拉坦(0.55 ml/kg)腹膜注射麻醉后，待角膜反射和肌张力消失后，将大鼠固定在脑立体定位仪上，按脑立体定位图谱(AP=2.22 mm，ML=3.0 mm，DV=2.8 mm)。用手摇牙科钻钻开颅骨，用微量进样器，向海马内注射1 μl孵育好的β-AP。5 min内注射完毕，留针5 min后缓缓起针，牙科泥封好颅骨，撒消炎粉，缝合，放入笼中常规饲养。术后每只每日肌注青霉素20万U，连续3 d，以预防感染。假手术组麻醉后，注射等量的生理盐水，缝合后放入笼中，并肌注青霉素以预防感染。

　　1.2.2 治疗方法 7 d后伤口完全愈合，饮食正常，无肢体残疾，即可开始治疗。针刺组用30号40 mm毫针，选取模型大鼠头部“百会”、“大椎”穴〔3〕，捻入1.6 cm，并持续捻转5 min，之后留针20 min。持续治疗一个月。西药组使用实验浓度为40 mg/ml的脑复康生理盐水溶液，每日一次灌胃，剂量6 ml/kg,共30 d。模型组和假手术组均给予等量生理盐水灌胃。

　　1.2.3 检测指标 术前将大鼠放入穿梭箱内，适应3 min，时间设置为5 min。打开电源，蜂鸣后穿梭箱底一侧A部通电，大鼠被电击至另一侧B部(被动逃避)，又一次鸣笛后，B部通电，大鼠即被电击至A侧(被动逃避)，如此反复，大鼠听到鸣笛后即从A侧逃到B侧，或从B侧逃到A侧(主动逃避)。由实验记录仪记录以下内容：动物序号，电击次数，刺激时间和主动逃避时间。治疗结束后再次进行行为学测试。行为学测试后，将大鼠脱颈处死，取全脑去除软脑膜血管、脑干及小脑后，用冰生理盐水冲洗血液，用滤纸拭干。称重后加入9倍冷生理盐水，电动匀浆机中研磨成10%匀浆，3 000 r/min离心15 min。取上清液，按照试剂盒说明检测AChE的含量。

　　1.2.4 统计学方法 数据用x±s表示，采用t检验和方差分析处理。

　　2 结果

　　2.1 穿梭箱实验结果 见表1。各组术前(治疗前)电击次数，电击时间比较无显著差异(P>0.05)，提示术前各组行为学测试结果大致相等。治疗前后模型组数据比较有非常显著差异(P<0.001)，提示造模成功。治疗后，两治疗组与假手术组比较有显著差异(P<0.05)。治疗后，针刺组与西药组比较无显著性差异(P>0.05)。两治疗组与模型组比较有非常显著差异(P<0.01)，说明针刺和西药对AD大鼠均有改善作用。

　　表1 各组大鼠行为学结果比较(略)

　　与治疗前比较：1)P<0.001;与治疗后假手术组比较：2)P<0.01;与模型组比较：3)P<0.01

　　2.2 生化指标检测 治疗后假手术组的AChE含量为(0.157 8±0.004 3) μmol/ml，模型组的含量为(0.465 3±0.057 1) μmol/ml，针刺组为(0.235 6±0.041 5) μmol/ml，西药组为(0.298 4±0.040 5) μmol/ml。模型组与其他各组比较，AChE含量升高(P<0.001)，提示造模成功。针刺组和西药组与模型组比较，AChE含量降低(P<0.01)。提示两种治疗方法均有效，但两组之间比较无显著性差异(P>0.05)。

　　3 讨论

　　Aβ在脑内的纤维状沉积是AD患者大脑中主要的病理变化〔4〕。近年来许多学者致力于寻找和研究AD动物模型，取得了很大的进展〔5〕。Giovannelli等给大鼠基底核注射Aβ-(1～40)和Aβ-(25～35)淀粉样多肽，结果在注射部位有刚果红染色阳性的物质积聚，基底核胆碱能神经元减少，胆碱酰化转移酶ChAT免疫活性下降与乙酰胆碱(ACh)释放减少相平行，大鼠的认知功能也发生障碍〔6〕。林煜等〔7〕选择海马CA1区进行Aβ微量注射，病理学观察显示注射区中心为刚果红染色阳性的Aβ核，其外是受损的神经元伴大量小胶质细胞浸润，最外层为反应性星形胶质细胞包绕。这与典型SP的构成基本一致。Y型迷宫检测显示模型大鼠的学习、记忆能力明显减退。本实验正是采用此种方法，较好地模拟了AD的行为学和病理学等方面的特征及对生化酶学产生的影响。

　　经临床验证，针灸疗法对AD的智能及社会活动功能康复有积极作用，其疗效肯定。针灸单穴及复方治疗本病在古代文献已有记载。《难经·二十八难》云：“督脉者……上致风府，入属于脑。”百会和大椎均属督脉穴位，百会为“三阳五会”，大椎为“诸阳之会”，为手足诸阳之会。督脉与脑密切相关，督脉通于脑。中医学认为脑为髓海，其气血上冲于盖(百会)，下在风府。AD的病机为气血两亏，肝肾不足或气滞血瘀、痰阻脉络而导致气血不能上养脑窍，进而髓海失聪所致。针刺百会、大椎可以激发经气，疏通经络，使脑髓的气血之荣养而复聪〔8〕。周莉等〔9〕观察到针刺百会、大椎可提高人的即时记忆能力及小鼠的学习成绩和记忆再现能力，故针刺百会可通督醒脑。

　　胆碱酯酶是胆碱能神经递质乙酰胆碱的水解酶，直接参与自主神经功能调节、肌肉运动、大脑思维、记忆等重要功能。目前已公认，学习记忆与中枢胆碱能神经系统关系极为密切。资料表明，慢性酒精中毒大鼠记忆功能的降低与ACh缺乏有关〔10〕。在中枢胆碱能神经系统中，ACh起着非常重要的作用。中枢胆碱能通路是构成学习记忆的重要通路，而ACh是其中重要的神经递质。它是由胆碱乙酰化酶合成，胆碱酯酶分解，通过ACh受体发挥生物学效应。学习记忆的生理过程极其复杂，而且需高级整合，而ACh作为进行及维持高级神经功能的一种重要介质，在记忆、思维和智能中起着不可替代的作用。另有一项研究证实，慢性应激大鼠空间学习记忆障碍的同时，海马ChAT活性降低，ACh含量下降〔11〕。近年来研究表明，AD病人脑组织中胆碱乙酰化酶活性明显降低，胆碱酯酶活性显著升高，造成ACh含量不足，导致中枢神经系统功能障碍，出现学习记忆及认知功能下降甚至智力丧失〔12〕。且已有实验证实，在AD发病过程中，大脑组织中的神经递质明显减少，尤其是大脑皮层的ACh及单胺类递质与血管性痴呆的智力下降密切相关〔13〕。因此通过检测治疗前后脑组织中AChE含量，即可推测出ACh的含量，从而判断AD大鼠的智能及记忆损害程度。在本实验结果表明，针刺AD大鼠的“百会”、“大椎”穴，可能有清除自由基，促进细胞代谢作用，从而降低AChE含量，改善大脑的学习记忆功能。

　　【参考文献】

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　　3 林文注.实验针灸学〔M〕.上海：上海中医学院出版社,1989:87.

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　　5 罗焕敏.阿尔茨海默病动物模型研究与应用进展〔J〕.国外医学·老年医学分册,1998;19(6):241-5.

　　6 吴 浩,袁伯俊.Alzheimer病动物模型研究进展〔J〕.国外医学·老年医学分册,1998;19(1):11-4.

　　7 林 煜.大鼠海马注射β-淀粉样蛋白建立记忆障碍模型的研究〔J〕.中华精神科杂志，2000;33(4):222-4.

　　8 莫飞智，赖新生，陈振虎，等.电针与氢化麦角碱对血管性痴呆大鼠脑内乙酰胆碱酯酶的作用〔J〕.中国老年学杂志，2001;21(3)：119-21.

　　9 周 莉.针刺百会穴对记忆影响的实验观察〔J〕.黑龙江中医药，1992;14(3)：41-7.

　　10 Melis F,Stancampiano R,Imperato A，et al.Chronic ethanol consumption in rats:correlation between memory performance and hippocampal acetylcholine release in vivo〔J〕.Neuroscience,1996;74:155.

　　11 胡旺平，李雪梅，化长林，等.慢性应激对大鼠学习记忆及海马乙酰胆碱含量和胆碱乙酰转移酶活性的影响〔J〕.中国行为医学科学，2002;11(4)：370.

　　12 周亚宾.醒神丸对老年性痴呆动物模型行为学和脑内胆碱酯酶活性的影响〔J〕.中国中医药科技，2000;7(3)：150.

　　13 O′Brein MD.The effect of M receptor on dementia 〔J〕.Dementia，1994;(5):133.