半胱氨酰白三烯受体1在人脑胶质瘤中的表达及意义

脑恶性胶质瘤是常见的恶性肿瘤,恶性程度高,呈浸润生长,手术不能完全切除,易复发。有研究显示半胱氨酰白三烯(”sLTs)在恶性胶质瘤中合成增加[19],然而CYsLTs受体与恶性胶质瘤之间的相互关系仍不清楚,受体的表达量与胶质瘤的恶性程度有否存在相关J眭有待进一步阐明。故我们收集浙江大学医学院附属第二医院神经外科2002年8月2012年12月手术治疗的48例胶质瘤病人,采用免疫组化方法检测CysⅢ1受体在48例人脑胶质瘤和3例正常脑组织中的表达(此实验方案得到浙江大学医学院附属第二医院伦理委员会批准),以探讨咖sLT1受体在脑胶质瘤中的表达情况及其与病理级别的相互关系,从而为临床治疗脑胶质瘤寻找新的途径。

1材料与方法

1.1一般资料男33例,女15例;年龄5~78岁,平44.5岁。正常对照组:男2例、女1例,平均年龄33.3岁,分别取自深部良性肿瘤患者手术途径中必须切除的少许肿瘤周围相对正常脑组织。肿瘤标本病理分级依据WH02007年中枢神经系统肿瘤分类标准,星形胶质细胞瘤分成低级别(I~Ⅱ级)组31例和高级别(Ⅲ~Ⅳ级)组17例。

1.2主要试剂抗人”sLT1抗体购自美国Cmarl Cllemicd公司;生物素标记的抗山羊瑰G抗体、生物素标记的抗兔坨G抗体、HRP标记的抗生物素抗体均购自美国钉med公司。

1.3苏木素伊红染色石蜡包埋后常规病理切片,二甲苯脱蜡15min×2次,梯度乙醇(1O0%,%%,80%,20%,50%)脱二甲苯各51111n;水洗后,苏木素染色4min,水洗后用分化液(75%乙醇+1%盐酸)分化2s;水洗后用温水(50oC)蓝化20s;冷水冷却后镜检。如染色效果不佳,重复苏木素染色及以后各步骤。然后,20%乙醇1血n,o5%伊红染色1~15min,乙醇梯度(95%,95%,100%,IOO%)脱水各2而n,二甲苯透明5而n×3次,以中性树胶封片.

1.4免疫组织化学染色取切片,脱蜡、水化组织切片;3%过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶:采用抗原修复液(0.0IM,PH6.0枸椽酸盐缓冲液)进行抗原修复;10%正常羊血清封闭液封闭非特异性抗原;每张切片加1滴5ug/mg的抗Cy乩T1抗体或抗q乩T2,4。c孵育ld;然后,以生物素标记的抗羊IgG以及HRP标记的抗生物素(钉med,USA),按顺序各孵育2h;以0.01%DAB显色,蒸馏水冲洗后,予苏木素复染,0.1%盐酸分化,自来水冲洗,PBS冲洗返蓝。切片经过梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封片。阴性对照切片取取正常脑组织切片,以正常羊血清处理,细胞核以苏木素复染,采用PBS代替一抗.

1,5结果评估免疫活性指数计算按照Kr苟Cwsl【a[3]的方法,即阳性细胞的比例数和染色亮度值的乘积之和c对于不同的染色亮度,每一种成分单独记算比例,再将所得数据相加后得到。在未知病理诊断的条件下,高倍镜(10×们)下随机取5个视野分别按照免疫染色的三级亮度分别和其所占的比例相乘,再相加后得到。阳性肿瘤细胞的百分比是用半定量的方法评估整个切片,按照以下的标准评定每一个标本:染色比例按照0(0~4%),1(5%~γ%),2(乃%~⒆%),3(50%~74%)和4(75%~1OO%)。免疫染色的亮度按照0(无染色),1(浅染色)和2(深染色)确定。例:一个标本中有笏%的肿瘤细胞强阳性(1×2=2),28%的肿瘤细胞弱阳性(2×1=2),其它的肿瘤细胞没有染色(0×2=0),总的免疫活性指数是2+2+0=4。

1.6统计学处理所有数据运用SPSsI6.0软件分析,采用单因素方差分析,首先进行方差齐性检验,方差齐者采用"D法,方差不齐者采用Tamhan’s T2法,以P(0。“为有统计学意义.

2结果

qsLT1受体阳性表达表现为细胞浆呈棕黄色染色(图A),而在阴性对照(PBS代替一抗)则无染色(图B),少数几例高级别肿瘤在细胞核的核膜有表达(图C)。”sLT1受体在相对正常的脑组织仅表达在微血管内皮细胞,在其他细胞不表达(图D)。在各级别的脑胶质瘤细胞中,CysLT1受体在星形胶质细胞瘤和神经节胶质细胞胞瘤中均有诱导表达,在肿瘤周围的神经元样细胞和胶质样细胞均有很强的诱导表达,在小血管内皮细胞中表达增加,并且表达强度(免疫活性指数)随着肿瘤恶性程度的升高而增加(见表1)。

3讨论

恶性胶质瘤是原发于颅内、发生于神经外胚层的最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,可发生在任何年龄,恶性度极高,呈浸润生长,手术不能完全切除,易复发。在目前的治疗条件下,平均生存时间小于3年。因此对胶质瘤发生发展机制及其防治机制的研究具有重要的意义。半胱氨酰白三烯(qsLTs),包括LTC4、LTD4和LTE4,是5-LOx代谢途径的重要代谢’产物GqsLTs通过其受体(包括”sLT1和”sLT2受体)发挥作用。CysLT1受体主要介导平滑肌痉挛、血管通透性增高、嗜酸细胞聚集、黏液分泌、血管扩张/收缩、心脏抑制等反应[4];CysLT2受体的作用尚不明确,可能与血管反应有关。既往研究发现CyTs及其受体与脑缺血、脑外伤、脑感染性及炎症性疾病有密切关系[5]。本实验发现,CysW1受体在正常脑组织主要表达在微血管内皮细胞,而在星形胶质细胞瘤和神经节胶质细胞瘤中均有诱导表达,在肿瘤周围的神经元样细胞和胶质样细胞则有很强的诱导表达,并且在小血管内皮细胞中表达增加。此外还发现CysLT1受体阳性的肿瘤细胞的比例和染色强度随着脑胶质瘤恶性程度的升高而增高。高级别的胶质瘤相对于低级别的胶质瘤,C/vsLT1的免疫活性指数明显升高,统计分析发现脑胶质瘤细胞各病理级别(按照WHO脑胶质瘤病理分级)之间的免疫活性指数有显著差别。在本实验所检测的48例脑胶质瘤标本中免疫活性指数随着肿瘤病理级别的升高而增加,这说明CysLTs及其受体在脑胶质瘤的发生、发展过程中起作用。这与5-LOⅩ在脑肿瘤中表达增强的现象相似,5-L0X增加的量也与肿瘤的分级有关,在恶性度高的星形胶质细胞瘤病人,5-LOX增加更加明显并呈颗粒状聚集,表明其被激活。肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的支持,一旦新生血管长人肿瘤组织,肿瘤细胞就会加速生长。脑胶质瘤生长过程中同样需要有肿瘤细胞浸润核转移能力的增强,新生血管的增加[6]。这是肿瘤发生、发展和恶变的必要条件和重要环节,这保证肿瘤在无限增殖过程中有充足的养份。本研究发现在正常脑组织中CLT1受体主要表达在微血管内皮细胞;脑胶质瘤时CysLT1受体可诱导表达在神经元和胶质细胞以及微血管内皮细胞。本实验的结果直接显示了Cl/sLTs受体在血管内的表达特征。据报道,CysLT1受体基因敲除后使小鼠微血管渗出减少,CyT1受体拮抗剂P1an1ukast和Motelukast可明显减少脑缺血后血浆白蛋白渗出和脑水肿,并改善神经功能[7];确定了CysLT1受体参与血管反应。这些报道均和本实验所得结果相一致。我们推测,Cy乩T1受体可能参与肿瘤新生血管的生成。有证据表明,外周组织q乩Ts及其受体,与生长因子TGF-β及其受体存在交互作用[9]。而TGF-β1与肿瘤关系密切[iO],如在恶性胶质瘤TGF-β1及其受体表达量均增加,而且其表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关;高表达TGF-β受体使星形胶质细胞对生长抑制因子的敏感性降低,使细胞出现过度增殖;高水平的TGF-β使细胞的迁移加快,推测与恶性胶质瘤的高浸润性生长有关[1l]。本实验数据显示,ClsLT1受体在脑胶质瘤中表达随着肿瘤恶性程度的增加而增加,我们推测CLTs及其受体也与恶性胶质瘤的高浸润性生长有关。并且和最近报道LTD4及其,JsLT1受体在介导炎症引起的大肠腺癌上有重要的作用的研究结果相一致[12];同时,在腺癌细胞发现CysLT1受体向核膜移位的现象,核膜上的受体能通过ERK途径,促进肿瘤细胞的增殖。在本实验也同样发现在高级别肿瘤细胞核的核膜有sLT1受体表达。这些结果强烈提示,sLTs及其受体参与肿瘤的调节。

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