人参皂苷Rb1对急性束缚性应激大鼠海马组织酪氨酸激酶BmRNA表达的影响

急性应激是机体在各种内外环境因素及社会、心理因素刺激时所出现的全身性非特异性适应反应，可以引起大脑功能减退及神经元损害，海马是应激时中枢神经系统损伤的主要部位[1]。酪氨酸激酶B (tyrosine kinase B,TrkB)在海马组织大量表达，是脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor , B DN日的高亲和力受体，两者结合对恢复神经元正常生理功能、挽救神经元变性及突触重塑等具有重要作用[3-4]。同时在急性应激情况下，机体激活下丘脑一垂体一肾上腺轴(H PA轴)，促使血浆中促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH)和皮质酮( corticosterone, CORT)的浓度增加，是对抗外来突发事件的一条重要反馈和自我保护途径[[5。人参皂昔Rb。作为人参中的主要有效成分，其对缺血性脑损伤、癫痛、阿尔茨海默病等多种神经系统疾病具有一定的疗效[6-8]。目前国内关于急性束缚性应激对海马TrkB m RNA表达影响的文章尚少，也鲜有关于人参皂昔在这一方面的研究。本实验观察急性束缚性应激对大鼠海马组织TrkB m RNA表达的影响，并研究人参皂普Rb:预处理对急性应激血浆 ACTH和CORT及海马区TrkB mRNA表达的影响，并探讨其可能机制。

材料与方法

1动物健康成年SD大鼠18只，SPF级，雄性，7周，体重(250士10) g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物生产许可证号:SCXK(沪) 2007一0005。于实验前7天购买并饲养于标准动物房中，给予充足的水分和食物。

2药物、试剂及仪器人参皂昔Rb,(批号: 10072432，含量)98.0，购于上海同田生物技术股份有限公司)，使用时将其溶解于生理盐水中，于使用当天配制成2 mg/mL浓度;大鼠COR一和ACTH ELISA试剂盒(购于上海西唐生物科技有限公司); Trizol试剂盒(Invitrogen , Cat. 15596，美国);反转录试剂盒(Bio-Serve Cat No: BS-PCR005) ; PCR扩增试剂盒(Bio-Serve Cat No: BS-PCR003 ) ;10% 水合氯醛;ZH一TXQ型筒形束缚器(杭州雷琪实验器材有限公司);酶标仪(DENLEY DRAGON Wellscan MK 3 , Thermo，芬兰);AB I 7500型定量PCR仪 (ABI，美国);微量分光光度计(Thermo, Nano- Drop1000，美国)。

3分组、造模与给药将18只大鼠按随机区组法分为正常组、模型组和给药组，每组6只。正常组不作任何处理。模型组采用ZH -TXQ型筒形束缚器束缚 2h。操作方法:抓住大鼠尾端，使其钻人束缚器，调节束缚器的长度使大鼠制动2 h[9/10]。给药组于造模前 30 min给予人参皂昔Rb, (40 mg/kg)[11]腹腔注射，余同模型组。

4 ELISA法检测血浆ACTH和COR下浓度大鼠造模前及造模结束后即刻用10%水合氯醛 ( 3 m L/kg)进行腹腔注射麻醉，再用肝素化的1 mL 针筒通过目内毗静脉采血1 mL，收集在冷冻过的肝素化的EP管中，4℃,3 000 r/min离心15 min，取血浆标本于一20℃保存。采用ELISA法检测AC丁H和 COR丁浓度，按试剂盒说明书进行操作。以造模后血浆COR下ACTH含量较造模前显著增加作为造模成功的评价标准。

5实时荧光定量RT一PCR检测海马组织TrkB m RNA表达造模结束后0.5 h，大鼠深麻醉后断头取脑，冰上游离海马组织，迅速置于液氮中，后于一80℃保存。采用实时荧光定量RT一PCR检测大脑海马组织中TrkB mRNA表达量。使用Trizol试剂提取RNA，甲醛变性胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度法在260,280 nm波长处测定RNA样品吸光度(A)值，计算RNA纯度和浓度。逆转录成 cDNA。引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计，引物序列见表1。反应体系组成:2 x PCR Master Mix- ture 15 uL,PCR特异引物F 0.5uL, PCR特异引物 R0.5 uL，模板余下体积用水补足到30uL。各指标按以下程序进行:95℃,3 min;35一40个循环 (95℃，30 s;55℃，30 s;72℃，30 s);72℃， 15 min。目的基因浓度除以基因(18 S)的浓度，即为此基因校正后的相对含量。

6统计学方法应用SPSS 17. 0软件进行统计学分析，计量资料以X士S表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P < 0. 05为差异有统计学意义。

结果

1各组大鼠造模前后血浆ACT日,COR下含量比较(表2)造模前，各组血浆ACTH,CORT含量比较，差异无统计学意义(P> 0. 05 )。造模后，模型组和给药组血浆AC丁日,COR丁含量均较本组造模前显著上升，差异有统计学意义(P< 0. 05 );巨模型组明显高于正常组同期(P < 0. 05 )，给药组明显高于模型组同期(P<0. 05)。

2各组大鼠海马组织TrkB mRNA表达的相对含量比较(表2)与正常组比较，模型组海马组织 TrkB mRNA表达水平下降，差异有统计学意义沪< 0. 05 );给药组海马组织TrkB mRNA表达水平较模型组升高，差异有统计学意义(P < 0. 05)。

讨论

应激是多种疾病如代谢类疾病、心血管疾病以及精神类疾病等的风险因素。随着研究的进展，发现应激对中枢系统多种神经递质传导通路有很大的影响[12]。海马是应激对大脑产生作用最重要的区域之一，目前关于应激对大脑海马影响的研究很多，并发现应激可以使海马的细胞因子N F-KB , p-38蛋白激酶等发生改变[14-16]，但关于急性束缚性应激和TrkB的研究尚少。

本实验采用急性束缚性应激模型，观察大鼠海马区TrkB mRNA表达量的变化。结果发现，急性束缚2h后大鼠海马区TrkB mRNA表达量下降。 研究表明，TrkB信号传导在兴奋性突触形成过程中起着重要作用，其主要机制可能是通过TrkB信号介导的自主细胞信号作用于突触前后细胞，从而使兴奋性突触发生[15]。这一过程为突触发生提供一个生长和稳定的环境[15]。应激会导致大脑海马突触减少，海马体积萎缩等[16]，因此TrkB可能介导这一过程。同时TrkB信号还介导下游几条通路，分别是丝裂原激活的蛋白激酶/MA户激酶( MAPK)通路、胞内磷脂酸肌醇激酶3 ( P13K)通路和y_磷脂酶C-Cat' ( PLCy-Cat')通路[17]。这3条通路介导各种生物学改变，同时也与多种疾病发生关系密切。由此可见， TrkB可能介导了应激所导致的生理病理性改变，同时也可以解释应激所导致疾病多样性的原因。至于具体疾病的具体途径，尚待进一步研究。 人参是传统的补益中药，人参皂昔Rb。是人参的代表成分之一:大量研究发现其可以改善记忆功能、抑制脑神经细胞凋亡、保护海马神经元[18]。已有研究证实人参皂昔Rb:可促进大脑神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和丁rkA的表达[18]。

本研究发现急性束缚性应激使大鼠海马TrkB m RNA表达明显下降，故采用人参皂背Rb:预处理方法，探讨其对这一过程是否存在保护作用及可能机制。结果发现，给药组造模后可以维持海马TrkB m RNA的正常表达量，从而达到缓解急性应激的效果。其具体机制可能与人参皂营具有钙通道拮抗及氧化作用等有关[19]，尚待进一步研究。 同时，研究认为急性应激是糖皮质激素(人体为皮质醇，大鼠为皮质酮)增加的过程.有研究表明急性应激激活H PA轴致使其释放的ACTH及 COR下含量增高，与其受体结合，从而产生一系列的自我调节作用。本研究发现急性束缚2 h后血浆 CORT和ACT日含量明显上升，提示造模成功，同时人参皂昔Rb。可以升高血浆CORT和ACT日的含量，提示其可能与增强急性应激的自我保护作用有关。然而人参皂普Rb。上调急性应激下血浆中CORT和 ACTH含量的具体机制尚不明确，同时是否还存在其他的保护通路有待于进一步研究。

综上，急性应激使大鼠海马区TrkB mRNA表达量明显下降。人参皂昔Rb。预处理可升高血浆 CORT和ACTH含量，同时维持海马TrkB m RNA的正常表达量。本实验对急性应激性疾病发病原因进行了探讨，同时为临床使用人参皂昔治疗此类疾病提供了理论基础和科学依据。

参考文献

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[2] Wang Y,Liu J,Zhang Z,et al.Anti-neuroinflammation effect of ginsenoside Rbl in a rat model of Alzheimer dis-ease. Neuroscience Letters . 2011

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[5] Miller DB,O‘Callaghan JP.Aging, stress and the hippocampus. Ageing Research Reviews . 2005

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[7] Minichiello L.TrkB signalling pathways in LTP and learning. Nature Neuroscience . 2009

[8] S Levine.Influence of psychological variables on the activity of the hypothalamic–pituitary–adrenal axis. European Journal of Pharmacology . 2000

[9] Yun S J,Park H J,Yeom M J,et al.Effect of electroacupuncture on the stress-induced changes in brain-derived neurotrophic factor expression in rat hippocampus. Neuroscience Letters . 2002

[10] Sapolsky R M.Why stress is bad for your brain. Science . 1996