人参二醇组皂苷对人胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的影响

　　作者：周丽琴 作者单位：北华大学附属医院神经内科，吉林 吉林 132013

　　【摘要】目的 观察人参二醇组皂苷(PDS)体外对U251细胞增殖及凋亡的影响。方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度PDS对U251细胞增殖活力的影响;吖啶橙染色观察PDS诱导细胞凋亡情况;流式细胞仪分析细胞周期并计算细胞平均凋亡率;免疫细胞化学技术观察细胞内半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)9的表达。结果 经中(100 mg/L)、高(200 mg/L)剂量的PDS处理后，U251细胞生长受到不同程度抑制，且呈现剂量依赖性;吖啶橙荧光染色可见经中、高剂量PDS处理后的细胞呈现凋亡形态，并随药物剂量增加凋亡细胞数增多;流式细胞术结果显示，PDS可明显提高细胞的凋亡率，呈剂量依赖关系;免疫细胞化学染色结果表明，随着PDS剂量增加，细胞内激活的caspase 9的表达上调。结论 PDS体外对U251细胞增殖具有明显的抑制作用，其机制可能与诱导细胞凋亡有关。

　　【关键词】 细胞凋亡;人参二醇皂苷;细胞周期

　　人参为五加科多年生草本植物，其成分具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性作用〔1〕。人参皂苷是人参中主要的有效成分，迄今已确定结构的至少在30种以上，人参二醇组皂苷(PDS)即是其中一种，具有抗缺血再灌注损伤、清除氧自由基、抗氧化、阻滞钙通道等多种生物学效应〔2，3〕。本研究通过观察PDS体外对U251细胞增殖及凋亡的影响，探讨其抗肿瘤机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂

　　PDS由吉林大学药学院天然药物分析实验室提取;四甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国Sigma公司产品;激活的半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)9多克隆抗体购于Takara公司，顺铂为山东齐鲁制药厂生产。

　　1.2 细胞系及培养条件

　　人胶质瘤细胞株U251(中科院上海细胞生物化学研究所提供)培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，置37℃、5%CO2湿化的培养箱中，待细胞长满80%培养瓶时，分组加药。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 实验分组

　　RPMI1640空白对照组(A组);2 μmol/L顺铂组(阳性对照组，B组);PDS低剂量(50 mg/L)组(C组)、中剂量(100 mg/L)组(D组)、高剂量(200 mg/L)组(E组)。

　　1.3.2 细胞形态观察

　　取对数生长期细胞,调整细胞密度为1×105接种于24 孔板,1 ml/孔。培养过夜后换新鲜的培养液,按前述分组加药，48 h后倒置显微镜下观察细胞形态。

　　1.3.3 MTT比色法

　　在96孔培养板，接种细胞1×105/孔，每组4孔，加药孵育20 h及44 h后每孔加MTT(5 g/L)20 μl，继续孵育4 h吸弃培养液，每孔加入DMSO 100 μl，震荡10 min，用酶标仪(波长570 nm)测定各孔吸光度值(A)，计算细胞生长抑制率，抑制率≥30%为细胞对该药敏感。抑制率=(对照组A值-给药组A值)/对照组A值×100%。

　　1.3.4 吖啶橙染色

　　将10 mg吖啶橙溶于100 ml、pH值为6.8的PBS中，过滤后4℃避光保存。细胞爬片经不同药物处理后，加入20 μl吖啶橙储存液，荧光显微镜下观察，拍照。

　　1.3.5 流式细胞仪检测

　　传代培养的U251细胞接种于培养瓶中(1×106/瓶)，次日加药处理，48 h后收集细胞，冷PBS洗2次，-20℃、70%的冷乙醇固定，加入115 ml PI (50 mg/L)染色。混匀后上流式细胞仪做单参数分析，用累积曲线分割法计算各期细胞比例。

　　1.3.6 免疫细胞化学染色

　　将大小适合的盖玻片放入6孔培养板中，接种细胞为5×105/孔，37℃、5% CO2中培养，次日加药，继续培养48 h，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，免疫细胞化学技术观察细胞内激活的caspase9表达情况。

　　1.4 统计学处理

　　数据处理采用SPSS9.0统计软件，数据以x±s表示,组间比较采用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 PDS对U251细胞生长的影响

　　2.1.1 细胞形态观察

　　A组细胞贴壁能力强，细胞生长旺盛，形态完好。经PDS处理48 h后,D、E组细胞形态均发生明显改变，即细胞呈现类圆形，周缘毛糙不规则，胞质中颗粒较多，贴壁能力下降，且出现悬浮细胞和细胞碎片，以E组较为突出，48 h后C组也可见少许死亡细胞出现。表明中，高剂量PDS体外可以抑制U251细胞生长。见图1。

　　2.1.2 不同药物对U251细胞增殖抑制作用

　　随着PDS浓度增加和作用时间的延长,细胞增殖抑制率逐渐增高,且呈明显时间、剂量依赖性。见表1 。表1 不同时间PDS对U251细胞的增殖抑制率(略)

　　2.2 细胞凋亡检测

　　2.2.1 吖啶橙染色

　　A组细胞呈均匀绿色，形态规则，未见凋亡细胞;D、E组细胞出现不规则橘黄色荧光，细胞体积变小，胞核皱缩，呈现凋亡细胞的形态改变，且个别细胞胞膜破裂。见图2。

　　2.2.2 流式细胞术结果

　　与A组相比,给药48 h后，D、E组在G1期前出现明显凋亡峰，呈现剂量依赖关系。见表2。表2 给药48 h PDS对U251细胞周期及凋亡率的影响(略)

　　2.2.3 细胞免疫化学结果

　　A组细胞caspase9表达弱阳性，经PDS处理的细胞casapae9表达明显上调，胞质中出现大量的棕黄色颗粒，随时间延长，剂量增加阳性细胞数增多，染色增强。见图3。

　　3 讨 论

　　胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，约占颅内肿瘤的46%，占成年人全身肿瘤的2%;恶性胶质瘤的发病率为(5～8)/100万，在1998年WHO公布的按死亡率顺序排位中，恶性胶质瘤为34岁以内患者的第2位死亡原因，35～60岁患者的第3位死亡原因〔4〕。胶质瘤浸润广泛，手术极难全切，具有高发病率，高致残率和高死亡率，目前临床治疗效果难以令人满意。目前尚缺乏有效的治疗手段。寻找新的治疗手段成为神经外科的研究热点之一。

　　本实验通过MTT法观察细胞生长抑制情况,用吖啶橙染色和流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期改变。结果表明,PDS对人U251细胞在体外有抑制作用,且随剂量的增长,作用时间延长，抑制作用增强。生长抑制试验中，当药物浓度为200 mg/L时，抑制率达37.26%，表明U251细胞经PDS处理后体外生长受到明显的抑制作用。

　　正常细胞周期中存在周期调节控制点,而癌细胞的细胞周期失去了周期控制点的调节，可以无限增殖。如果药物能恢复周期控制点的作用，使肿瘤细胞在任何一个环节出现障碍使其细胞不能得到增殖〔5〕。本实验流式细胞仪检查结果分析表明，200 mg/L PDS可使细胞大部分阻滞于S 期,延缓由S期进入G2期，因此细胞增殖能力大大限制。近年来研究表明,许多抗癌药物均能诱导肿瘤细胞发生凋亡,这可能是这些药物抑制肿瘤生长的机理之一。

　　已知caspase家族是细胞凋亡发生核调控的重要因素，caspase家族中又以caspase9为最重要的调节分子〔6〕。本研究通过免疫组化结果发现，空白对照组U251细胞只有少量激活的caspase9蛋白表达，而PDS可上调caspase9表达且呈现剂量依赖关系。表明PDS可能激活了细胞内线粒体依赖途径的激活caspase8，然后作用于 Bid(Bcl2 inhibitory BH3domaincontaining protein)，形成有活性的tBid(truncated BID)， tBid使线粒体释放Cytochrome C，Cytochrome C再与 Apaf1和Procaspase9形成复合体激活caspase9，激活了的caspase9再通过caspase9、7，降解细胞骨架蛋白，使U251细胞凋亡〔7，8〕，至于PDS诱导U251凋亡的信号转导通路的具体机制尚需进一步探讨，PDS抗胶质瘤细胞增殖的特性有可能开发成为治疗胶质瘤的辅助药物。

　　【参考文献】

　　1 国家药典委员会.中药大辞典〔M〕.上海：上海科技出版社，2000:35.

　　2 王建春，孙晓霞，王 志,等.人参二醇组皂苷对内毒素休克大鼠脑皮质TLR4mRNA表达的影响〔J〕.中国病理生理学杂志，2005;21(12):24313.

　　3 李 峰，郭聪慧，李 扬,等.人参二醇组皂苷对大鼠有丝分裂原反应性的影响〔J〕.免疫学杂志，2004;20(3):2435.

　　4 Mischel PS，Cloughesy TF.Targeted molecular therapy of GBM〔J〕.Brain Pathol，2003;13(1):5261.

　　5 Viola S，Consoli GM，Merlo S,et al.Inhibition of rat glioma cell migration and proliferation by a calixarene scaffold exposing multiple GlcNAc and ureido functionalities〔J〕.J Neurochem，2008;107(4):104755.

　　6 Gdynia G，Grund K，Eckert A,et al.Basal caspase activity promotes migration and invasiveness in glioblastoma cells〔J〕.Mol Cancer Res，2007;5(12):123240.

　　7 Bhattacharjee M，Acharya S，Ghosh A,et al.Bax and Bid act in synergy to bring about T11TSmediated glioma apoptosis via the release of mitochondrial cytochrome c and subsequent caspase activation〔J〕.Int Immunol，2008;20(12):1489505.

　　8 Stegh AH，Kesari S，Mahoney JE，et al.Bcl2L12mediated inhibition of effector caspase3 and caspase7 via distinct mechanisms in glioblastoma〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2008;105(31):107038.