层黏连蛋白α1、α2、α3、α5亚基在人脑胶质瘤中的表达

 作者：梅文忠    作者单位：福建医科大学附属第一医院神经外科，福州 350005

【摘要】  目的 探讨层黏连蛋白（laminin，LN）α1，α2，α3，α5亚基在人脑胶质瘤中的表达特征。 方法 采用免疫组织化学SP法和图像分析技术分析77例脑胶质瘤、8例正常脑组织以及10例脑内转移瘤标本中LNα1、α2、α3、α5亚基的表达情况。 结果 （1）人脑胶质瘤中，LNα2，α3呈阴性，LNα1，α5阳性染色位于瘤细胞质及细胞膜，其阳性染色强度与病理级别密切相关（P<0.01）；（2）LNα5在血管内皮细胞及基膜呈阳性染色，染色强度与病理级别比较无统计学意义（P>0.05），但明显强于脑内转移瘤（P<0.05），后者常表现为基膜不连续弱阳性染色。 结论 （1）LNα1，α5亚基的表达强度与脑胶质瘤病理级别密切相关；（2）LNα5在脑胶质瘤和脑内转移瘤组织中血管内皮细胞及基膜表达的差异可能与瘤细胞转移行为有关。

【关键词】  脑肿瘤 神经胶质瘤 肿瘤转移 层粘连蛋白 免疫组织化学

　　Expression of Laminin α1、α2、α3、α5 Subunit in Human Brain Gliomas

　　MEI Wenzhong, LI Cheng, TAN Shulian, LIN Zhixiong, ZHOU Aiping, WANG Wei, CHEN Long

　　The Department of Neurosurgery，The Affiliated First Hospital, Fujian Medical University，Fuzhou 350005，China

    ABSTRACT:  Objective  To explore expression patterns of laminin α1、α2、α3、α5 subunit in the human brain glioma.  Methods  The expression of laminin α1、α2、α3、α5 subunit in 77 brain glioma,8 normal brain tissue and 10 metastatic tumor specimens were analyzed by immunohistochemistry and image analysis technique.  Results  1.There were negative expression of laminin α2、α3 subunit and positive expression of laminin α1、α5 subunit in the human brain gliomas, whose positive staining located in tumour cell membrane, plasma.  The positive staining intensity was correlated with pathological grade of glioma（P<0.001）.  2.There were also positive expression of laminin α5 subunit in blood vessel endothelial cells and basal membrane, which intensity was not correlated with pathological grade of glioma (P>0.05), but was stronger than expression in metastatic tumor (P<0.05).  Conclusion  1.The expression intensity of laminin α1、α5 subunit in tumor cells was closely correlated with pathological grade of glioma.  2.The expression difference of laminin α5 subunit in brain glioma and metastatic tumor was probably correlated with the metabasis behavior of tumor cells.

    KEY WORDS:  brain neoplasms; glioma; neoplasm metastasis; laminin; immunohistochemistry 　　福建医科大学学报  2008年7月  第42卷第4期梅文忠等：层黏连蛋白α1、α2、α3、α5亚基在人脑胶质瘤中的表达层黏连蛋白（laminin，LN）是一族具有多种生物学功能的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)糖蛋白，它们参与基底膜构建，对维持基底膜的完整结构起重要作用，还在细胞黏附、生长、迁移中扮演着至关重要的角色[1]。研究表明，某些LN分子在胶质瘤细胞中表达增高，且与肿瘤病理级别相关，参与胶质瘤侵袭性生长而罕见颅外转移行为的调控[23],但是以往的研究多是针对LN蛋白分子或某些LN亚型分子的研究，如LN5，LN8，LN9，LN10/11等。本实验采用免疫组织化学SP法检测LNα1，α2，α3，α5亚基在不同病理级别的脑胶质瘤中的表达情况，探讨其与人脑胶质瘤生物学行为的关系。

1  材料和方法

　　1.1  材料

　　手术切除并经病理检查证实的人脑胶质瘤标本77例，其中星形细胞瘤41例、少突胶质细胞瘤7例、混合型胶质细胞瘤10例、室管膜瘤9例、髓母细胞瘤3例、胶质母细胞瘤7例。77例中，男性49例、女性28例，年龄（35±5.9）岁（3～70岁）。参照2000年WHO神经系统肿瘤分类及分级标准：Ⅰ级10例，Ⅱ级34例，Ⅲ级23例，Ⅳ级10例；术前均未接受放疗或化疗。取10例经病理检查证实的非神经系统来源的脑内转移瘤标本，男性7例，女性3例，年龄（54±2.8）岁（45～72岁）。8例正常脑组织标本取自颅脑损伤行内减压术患者，男性5例、女性3例，年龄（37±4.3）岁（13～61岁）。所有组织标本取后立即用10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，研究时选取典型蜡块作2～4 μm连续切片。

　　1.2  方法

　　1.2.1  主要试剂

　　羊抗人LNα1，α2，α3，α5亚基多克隆抗体(浓缩型)购自美国SantaCruz公司；超敏SP试剂盒购自福州Maixin Bio公司。

　　1.2.2  免疫组织化学

　　使用柠檬酸盐（PH 6.0）高温高压修复法进行抗原修复，免疫组织化学使用超敏SP法，具体参照说明书进行。抗体工作浓度（1∶100）。

　　1.2.3  结果判断

　　定位于脑胶质瘤细胞质及细胞膜上根据染色程度及染色细胞百分率进行分析评分[3]：着色缺如者为0分、淡者为1分、适中者为2分、深者为3分；着色细胞占细胞记数百分率＜5%为0分、5%～25%为1分、26%～50%为2分、＞50%为3分；每张切片着色与着色百分率得分相乘为其最后得分：规定0～1分者为阴性（-）、2～3分者为弱阳性（+）、4～6分者为阳性（++）、>6分者为强阳性（+++）。

    在脑胶质瘤血管内皮细胞膜及血管基膜染色阳性的指标，利用ImagePro Plus 6.0软件测定阳性染色的血管内皮及基膜的平均光密度值（average optical density，AOD）和阳性染色的微血管管壁厚度（microvascular wall thickness，MWT）。

　　1.3  统计学处理

　　应用SPSS 11.5软件对检测数据进行统计处理，采用单因素方差分析、Kendall’s等级相关分析检验方法。P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结  果

　　2.1  LNα1，α5的表达

　　LNα1主要定位在肿瘤细胞膜上，病理级别越高染色越强；阳性染色的细胞呈巢状分布或散在分布，在少数高级别胶质瘤标本中还可见阳性染色的瘤细胞围绕着血管分布，而在血管内皮细胞及基膜无染色（表1～2，图1）。表1  LNα1，LNα5在胶质瘤细胞中的阳性表达强度与病理级别的关系（略）表2  LNα5在血管内皮及基膜中的阳性表达强度与脑内肿瘤恶性程度的关系（略）

    LNα5不仅在所有胶质瘤的瘤体及瘤周肿瘤细胞膜与细胞质上有染色，且病理级别越高染色越强；同时，血管内皮细胞及基膜也出现阳性染色，表现为靠管腔的一层内皮细胞和基膜呈连续、完整的阳性染色，但染色强度在胶质瘤各级别之间无明显差异。然而，LNα5在正常脑组织的血管内皮细胞及基膜无阳性染色，在脑内转移瘤的血管内皮细胞及基膜也仅见弱阳性染色，但染色基膜呈不连续，染色强度低于胶质瘤组；不过，胶质瘤和转移瘤标本血管腔中红细胞膜上均可见LNα5强阳性染色(图1,2)。

　　2.2  LNα2、α3的表达情况  LNα2、α3亚基在胶质瘤细胞及血管内皮细胞和基膜中均无阳性表达。

　　3  讨  论

    研究发现，LN能增强胶质瘤细胞活动性，促进胶质瘤细胞粘附和迁移，促进肿瘤的侵袭[1,3]。陈菊祥等利用含13939种人类基因的BioStarH40S型芯片筛选人脑胶质母细胞瘤与侵袭性相关基因的表达和功能，结果发现层黏连蛋白、血小板衍化生长因子受体A（PDGFRA）等8条细胞骨架和细胞外基质基因均在胶质母细胞瘤中显著上调[4]。研究也发现PDGFRA和LN可以促进肿瘤新生血管的形成，导致胶质母细胞瘤侵袭性增强[5]。最近，Kawataki等在体外实验中发现含α3的LN5和含α5的LN10可强烈的促进胶质瘤细胞迁移，含α1的LN1作用较弱，含α2的LN2和α4的LN8在体外对胶质瘤细胞迁移无促进作用[6]。本研究发现，LNα1、α5在胶质瘤的瘤体及瘤周、瘤细胞质与细胞膜均有表达，表明LN可由瘤细胞合成、组装、分泌；本研究发现LNα1、α5在胶质瘤细胞浆膜的表达强度与病理级别密切相关，随着病理级别的增高而表达增强，提示它们可能与瘤细胞恶性程度有关，促进瘤细胞之间或瘤细胞与ECM、血管基膜之间的黏附和迁移。

 临床病理发现，脑组织虽是身体其他器官原发癌转移的好发部位，但颅内原发肿瘤却很少颅外转移，其原因也被认为与LN在脑胶质瘤中的分布特征有关[3]。本研究发现，LNα5在胶质瘤血管内皮细胞和基膜上表达增高，且LNα5在基膜上的表达是连续的、完整的，与之前的文献报道基本相符；而在脑内转移瘤中见LNα5在血管内皮和基膜的表达较弱，且不连续、有断裂。提示LNα5可能影响胶质瘤细胞侵袭血管向颅外转移。

    基膜上的LN除了可抑制瘤细胞穿越血管壁而发生转移外，还可通过与瘤细胞表面存在LN受体（整合素类和非整合素类）的结合，诱导瘤细胞的黏附和迁移[7]。Lugassy等用内皮细胞形成类管腔结构并与肿瘤细胞共培养发现，胶质瘤细胞可沿着管腔外表面前行，并包绕在血管基底膜成分LN的外周[8]。提示本研究中的LNα5可能在影响胶质瘤颅外转移的同时，还诱导胶质瘤细胞沿着血管基膜向正常脑组织迁移。此外，在临床和不同动物实验中也观察到脑胶质瘤细胞还常沿有髓纤维（束内、束周及束间）侵袭，研究表明虽然脑胶质瘤细胞系能特异地粘附到中枢神经系统髓磷脂提取物，但比粘附到纯化的LN上明显要慢[9]。

    吕德兰血型糖蛋白（Lu），也称为基底细胞黏附分子（BCAM），是表达于红细胞膜上的一种LN受体，属于免疫球蛋白超家族，研究表明它与LN的高亲和力结合有助于器官发生、血管形成、红细胞生成，研究还表明它在一些疾病和恶性肿瘤中高表达，并和其它的黏附受体一起涉及到肿瘤的恶性转化和转移[1011]。Kikkawa等研究发现在ECM蛋白中，仅仅含α5链的LN是Lu/BCAM的配体[12]。本研究发现LNα5除了在血管内皮细胞和基膜表达外，还在红细胞膜上呈阳性染色，胶质瘤和转移瘤标本中红细胞膜上染色远强于正常脑组织，胶质瘤与转移瘤之间染色无明显差异。提示高表达的LNα5结合到红细胞膜受体上，其来源有可能是内皮细胞合成、分泌的，LNα5与Lu/BCAM相互作用在红细胞运输、肿瘤营养、血管内皮增生/新血管生成等过程中可能起重要作用。

    不过，要确切地搞清楚是哪些LN亚基在脑胶质瘤的那些生物学行为中起作用？作用如何？分子机制何在？还需要借助现代分子生物学技术（基因敲除，基因转染、RNAi干扰技术等）在体内外实验（黏附、迁移、侵袭实验）中进一步研究。

【参考文献】  　　[1] Colognam H,Yurchenco P D. Form and funcation：the laminin family of heterotrimers[J]. Dev Uyn, 2000,218:213234.

　　[2] 江常震,陈锦锋,何理盛,等. 层黏连蛋白,MMP2、MMP9及TIMP1在人脑原发性胶质瘤的表达及临床意义[J]. 福建医科大学学报, 2001,35(1):49.

　　[3] 林志雄,张鹏飞,江常震,等. 人脑胶质瘤中LN、FN及p53基因蛋白的免疫组织化学与其侵袭微生态系统的相关性探讨[J]. 解剖学报, 2002,33(4):360365.

　　[4] 陈菊祥,卢亦成, 骆 纯,等. 利用基因芯片研究与胶质母细胞瘤侵袭性相关的基因[J]. 中华神经医学杂志, 2004,3(2):9395.

　　[5] Ljubimova J Y,Lakhter A J,Loksh A,et al. Overexpression of alpha4 chaincontaining laminins in human glial tumors identified by gene microarray analysis[J]. Cancer Research, 2001,61(14):56015610.

　　[6] Kawataki T,Yamane T,Naganuma H,et al. Laminin isoforms and their integrin receptors in glioma cell migration and invasiveness: evidence for a role of alpha5laminin(s) and alpha3beta1 integrin[J]. Exp Cell Res, 2007,313(18):38193831.

　　[7] Ruosatathi E. Control of cell motility and tumor invasion by extracellular matrix interactions Brit [J]. J Cancer, 1990,9:289292.

[8] Lugassy C,Haroun R I,Brem H,et al. Pericyticlike angiotropism of glioma and melanoma cells[J]. The American Journal of Dermatopathology, 2002,24(6):473478.

　　[9] Amberger V R,Paganetti P A,Seulberger H,et al. Characterization of a membranebound metalloendoprotease of rat C6 glioblastoma cells[J]. Cancer Research, 1994,54(15):40174025.

　　[10] Kikkawa Y,Miner J H. Review: Lutheran/BCAM: A Laminin receptor on red blood cells and in various tissues[J]. Connective Tissue Research, 2005,46:193199.

　　[11] Eyler C E,Telen M J. The Lutheran glycolprotein:a multifunctional adhesion receptor[J]. Transfusion, 2006,46(4):668677.

　　[12] Kikkawa Y,Moulson C L,Virtanen I,et al. Identification of the binding site for the Lutheran blood group glycoprotein on laminin α5 through expression of chimeric laminin chains in vivo[J]. J Biol Chem, 2002,277:4486444869.