MCP-1/CCR2通路参与骨髓基质细胞向脊髓全横断损伤区迁移的实验研究

 作者：丁鹏，路钢，杨智勇，王进昆，余化霖，薛黎萍， 李园园，冯忠堂，林荣安    作者单位：1. 昆明医学院第一附属医院神经外科， 云南 昆明 650032； 1. 昆明医学院第一附属医院神经外科， 云南 昆明 650032； 3. 云南省第二人民医院， 云南 昆明 650021； 4. 新加坡国立大学解剖系，新加坡 117597

【摘要】  　　【目的】 探讨单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）及其受体CCR2在骨髓基质细胞（MSC）体内、外迁移中的作用。【方法】 体外培养、纯化大鼠MSC，取第五代MSC行免疫荧光鉴定；免疫组化、RT-PCR检测纯化MSC表达CCR2情况；Boyden 小室法检测趋化因子MCP-1（5 ～ 500 ng/mL）对MSC的趋化迁移作用及其特异性。42只成年大鼠用于体内研究（脊髓全横断组24只，假手术组9只，正常大鼠9只），分别于术后1，3，7，14 d取材，行免疫组化检测MCP-1表达，或行MCP-1的Real-time PCR定量分析，或颈内静脉注射荧光标记的MSC，观察MSC向脊髓迁移情况。【结果】第5代MSC都表达间充质干细胞标记物Vimentin、Laminin及Fibronectin；细胞免疫荧光、RT-PCR证实MSC表达趋化因子受体CCR2；MCP-1（5 ～ 500 ng/mL）体外可趋化MSC迁移（P﹤0.05），抗MCP-1抗体可对抗其趋化迁移作用（P﹤0.05）。脊髓全横断组、对照组脊髓均表达MCP-1，但细胞分布、染色存在差异，影响MCP-1定量。脊髓损伤后趋化因子MCP-1 RNA在1d、3d及7d较对正常对照组差异有统计学意义（P < 0.05），术后14 d时MCP-1 RNA与正常对照相比差异无统计学意义（P ＞ 0.05），伴随其变化，脊髓损伤区迁移MSC较对照差异有统计学意义（P﹤0.05）。【结论】 MCP-1体内、外可趋化MSC迁移，MCP-1/CCR2通路参与MSC向脊髓全横断损伤区的迁移。

【关键词】  骨髓基质细胞 趋化因子 迁移 脊髓损伤

　　MCP-1/CCR2 Pathway Mediates Migration of Marrow Stromal Cells into Lesion Site of Completely Transected Spinal Cord

　　DING Peng, LU Gang, YANG Zhi-yong, WANG Jin-kun, YU Hua-lin, XUE Li-ping, LI Yuan-yuan, FENG Zhong-tang, LING Eng-ang

　　1. Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650032, China;

　　2. Brain Research Laboratory, Biomedical Engineering Research Centre, Kunming Medical College, Kunming 650031, China;

　　3. Department of Ophthalmology, Second People′s Hospital of Yunnan Provincial, Kunming 650021, China; 4. Department ofAnatomy, Yong Loo Lin School of Medical, National University of Singapore, Singapore 117597

　　Abstract: 【Objective】 To explore the roles of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and its receptor CCR2 in trafficking of marrow stromal cells (MSC) migration. 【Methods】 Isolated and cultured MSC for 5 passages, then using Vimentin, Laminin, and Fibronectin to identify MSC. Using immunofluorescence and RT-PCR to detect whether MSC, in vitro, express CCR2. Using chemotaxis assay (Boyden method) to detect whether MCP-1 (5 -500 ng/mL) effect MSC migration in vitro. A total of 42 adult rats were used in vivo study (24 rats for completely transected spinal cord models, 9 rats for sham operation and 9 rats for normal control). At 1, 3, 7, and 14 days after operation，expression of MCP-1 was detected by immunofluorescence, or real-time PCR was executed, and some rats were intravenously injected CFDA-SE labeled MSC to detect the migration of MSC in vivo.【Results】 After 5   passages, all MSC express Vimentin, Laminin, and Fibronectin. Immunofluorescence and RT-PCR show MSC expression, the respective receptors for MCP-1 and CCR2. MCP-1 in vitro induce the migration of MSC (P﹤0.05), and which can be blocked by anti-MCP-1. MCP-1 was expressed in the spinal cord of experimental groups and control groups. The distribution and staining of MCP-1 were differential in both groups, which affected the results of quantitation of MCP-1. Real-time PCR results revealed that there was significant increase of MCP-1 at 1, 3, and 7 days after operation compared to that of the normal control (P < 0.05). Subsequently, at 14 days postoperation, the expression of MCP-1 decreased to normal (P > 0.05). Intravenously injected MSC migrate to the lesion site of completely transected spinal cord where MCP-1 was assayed to be increased after spinal cord injury (P﹤0.05).【Conclusion】 MCP-1/CCR2 pathway mediates the migration of MSC into the lesion site of completely transected spinal cord.

Key words: marrow stromal cells; chemokine; migration; spinal cord injury

　　骨髓基质细胞（marrow stromal cells, MSC）是骨髓内造血干细胞以外的非造血干细胞，有多向分化潜能,在体内特定微环境或体外特定培养条件下,可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、心肌细胞、神经元及胶质细胞等[1-3]。目前，MSC已被应用治疗脑缺血、脑损伤、脊髓损伤等中枢神经系统疾病，并取得良好的疗效[4-7]。MSC移植治疗中枢神经系统疾病主要有两种方式：一为通过静脉或动脉直接注射MSC[4，5]，二为MSC损伤区局部注射[6，7]。Chen等报道[4，5]静脉或动脉直接注射MSC治疗脑缺血或脑损伤，可引起实验动物功能改善，但目前关于MSC向损伤区迁移的具体机制还不清楚。Wang等[8，9]报道单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)，白细胞介素-8 (interleukin-8，IL-8)及缺血脑组织提取液体外可诱导MSC迁移。但目前关于脊髓损伤后MCP-1的改变情况及静脉注射MSC向脊髓损伤区迁移情况未见报道。本研究拟观察体外培养MSC表达趋化因子受体CCR2情况，通过体外实验观察趋化因子MCP-1对MSC的趋化迁移作用，同时观察脊髓损伤后趋化因子MCP-1的变化及静脉直接注射MSC向脊髓全横断损伤区迁移的情况，以探讨MCP-1/CCR2通路在MSC体内、外迁移中的作用，为研究MSC在中枢神经系统疾病中的应用提供理论依据。

　　1  材料和方法

　　1.1  材  料       　　纯种Wistar大鼠（新加坡国立大学实验动物中心提供, 体外实验2只，体内实验42只），RNeasy Mini Kit，One Step RT-PCR Kit（QIAGEN, Germany），Light CyclerTM-Faststart DNA Master SYBR Green I (Roche, Germany)，CFDA SE Labeling Kit （Molecular Probes）。

　　1.2 大鼠MSC培养及免疫荧光鉴定      　　按我们文献报道方法体外培养MSC[6]，细胞传至第五代分别以羊抗Vimentin多克隆抗体(1 ∶ 200，Sigma)、兔抗Fibronectin多克隆抗体(1 ∶ 200，Chemicon)及兔抗Laminin多克隆抗体(1 ∶ 200，Sigma)行细胞免疫荧光鉴定。二抗为Cy3结合的兔抗羊（1 ∶ 200）及羊抗兔（1:200）荧光抗体，Olympus FluoViewTM 500激光共聚焦显微镜观察、拍照。

　　1.3  体外培养MSC表达趋化因子受体CCR2情况的检测

　　1.3.1  细胞免疫荧光检测 

　　以兔抗CCR2多克隆抗体（1 ∶ 100,Torry pines biolabs）检测体外培养MSC趋化因子受体CCR2的表达情况，二抗为Cy3结合的羊抗兔（1 ∶ 200）抗体，Olympus BX51荧光显微镜观察、拍照。

　　1.3.2  RT-PCR 检测 

　　按RNeasy Mini Kit (QIAGEN)说明提取MSC RNA，分光光度仪上定量及检测RNA纯度。参照One Step RT-PCR Kit（QIAGEN）说明行RT-PCR，CCR2上游引物为：CGCAGAGTTGACAAGTTGTG，下游引物为：GCCATGGATGAACTGAGGTA，序列长度233 bp。PCR反应条件如下：94 ℃变性1 min，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，36个循环。RT-PCR产物以20 g/L琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在GENE GENUS数码成像及分析系统中观察、拍照。

　　1.4  趋化因子MCP-1对MSC的体外趋化迁移作用及其特异性检测      　　MSC体外趋化实验在48-孔Boyden 小室上进行。25 ?滋L MCP-1以5 ng/mL、50 ?滋ng/mL及500 ng/mL浓度（DMEM条件培养基配置）加到趋化板的下层，对照组单纯添加DMEM条件培养基，以8 μm孔径的聚碳酸酯膜覆盖。消化MSC，细胞计数后，含5 g/L牛血清白蛋白的DMEM条件培养基混匀细胞至1.5 × 106 个/mL，50 ?滋L细胞悬液加到Boyden 小室上层，37℃ CO2培养箱培养10 h。10 h后，取出聚碳酸酯膜，刮去上层未迁移的MSC及碎片，去离子水冲洗3次，40 g/L多聚甲醛固定15 min，苏木精染色10 min，封片。光镜下观察、计数、拍照。为验证趋化因子作用的特异性，480 ?滋g/mL 抗MCP-1多克隆抗体及5 ng/mL MCP-1加到趋化板的下层，其他实验步骤同前。相同实验重复3次，计数6个高倍镜视野下（×400）细胞数，结果行统计学处理。

1.5 脊髓全横断损伤组及对照组趋化因子MCP-1的免疫组化检测

　　按我们文献报道方法制备脊髓全横断损伤模型18只[6]，70 mL/L水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，无菌条件下依次切开皮肤、皮下筋膜及肌肉，咬骨钳咬除T8-T10棘突及椎板，脊髓拉钩剥离脊髓，无菌剪刀剪断脊髓T10 节段，明胶海绵止血，依次缝合切口。假手术组只打开椎板。脊髓全横断术后腹部挤压3次/d，以利大鼠排尿，直至大鼠自发性排尿反射建立；青霉素皮下注射(20 000 IU/L, Sigma)预防尿路感染2次/d，1周后视有无尿路感染酌情应用；假手术组动物接受同样处理。手术后1、7及14 d各3只，另取Wistar大鼠3只作为正常对照，灌注、固定、取材（T9-11）、切片，片厚20 μm，间隔15张取一张切片，每组3张。按Vector ABC试剂盒说明操作，以含0.3%硫酸镍铵的DAB显色，甲基绿复染，脱水、透明后树胶封片，光镜下观察、拍照。

　　1.6  脊髓全横断损伤组及对照组趋化因子MCP-1的RT-PCR定量检测

　　1.6.1  脊髓RNA的提取 

　　制备12只Wistar大鼠脊髓全横断模型，手术后1、3、7及14 d，断头处死大鼠（每时间点各3只大鼠，另取Wistar大鼠3只作为正常对照），按Trizol试剂盒说明提取脊髓（T9-11）RNA，分光光度仪上定量及检测RNA纯度。

　　1.6.2  反转录反应 

　　将上述抽提RNA 按M-MLVRT试剂盒说明行反转录反应，产物置-20 ℃保存，以备RT-PCR 定量。

　　1.6.3  RT-PCR 定量

　　Real-time PCR 反应体系如下：5 ?滋L 反转录产物，5 ?滋mol/L 目的基因引物各1 ?滋L，5 × 反应混合物4 ?滋L，加水定容至20 ?滋L。95 ℃预热10 min后，95℃变性15 s，58 ℃退火10 s，72℃延伸20 s，反应45循环。MCP-1上游引物为：TCTCTTCCTCCACCACTATGCA，下游引物为：GGCTGAGACAGCACGTGGAT；GAPDH上游引物为：ACCACCATGGAGAAGGCTGG，下游引物为：CTCAGTGTAGCCCAGGATGC。RNA定量以Ct值表示，即PCR产物到达指数增长期的循环数,同时以样本中内对照GAPDH的量来标化,实验结果以相对于正常脊髓RNA量的2倍为有统计学差异。

　　1.7  MSC在脊髓全横断损伤组迁移情况的观察

　　1.7.1  脊髓全横断模型的制备 

　　制备脊髓全横断损伤模型3只；另取3只Wistar大鼠作为正常对照。

　　1.7.2  MSC的体外荧光标记 

　　为观察MSC在体内的存活、迁移及分化，我们应用5-（6-）羟基荧光素双乙酸琥珀酰亚胺酯[5-（and-6）-carboxy fluorescein diacetate succinimidyl ester ，CFDA-SE]标记移植的MSC，具体实验步骤参照CFDA SE Labeling Kit 说明。

　　1.7.3  颈内静脉注射荧光标记MSC 

　　脊髓全横断术后1 h，无菌条件下分离颈内静脉，将CFDA-SE荧光标记细胞悬液1.0 mL(1 × 106个/mL)经颈内静脉注入体内，正常对照接受相同处理。

　　1.7.4  MSC体内迁移情况的观察 

　　MSC颈内静脉注射后2周，将实验动物灌注、固定、取材（T9-11）、切片，片厚20 μm，间隔15张取一张切片，每组3张。荧光显微镜下观察、计数、拍照，结果行统计学处理。

　　1.8 统计学方法      　　所得数据均采用均数 ± 标准差（ｘ ± ｓ）表示，两组均数比较，应用SPSS11.5 for Windows统计软件包行t检验，P < 0.05为结果有统计学意义。

　　2  结 果

　　2.1  MSC的体外培养及其细胞免疫荧光鉴定       　　第5代体外培养MSC都呈Vimentin、Fibronectin、Laminin阳性(图1）；空白对照未见免疫荧光着色。MSC纯度高，可用于体外趋化迁移实验。

　　2.2  CCR2表达情况的免疫荧光组化及RT-PCR鉴定      　　纯化MSC呈CCR2阳性（图2），空白对照未见免疫荧光着色；RT-PCR琼脂糖凝胶电泳结果示：233 bp特异性扩增条带，与预期趋化因子受体CCR2扩增片段一致（图2）。

2.3  趋化因子MCP-1对MSC体外趋化迁移实验      　　鉴于MSC体外可表达趋化因子受体CCR2，我们用Boyden小室检测趋化因子MCP-1对MSC的趋化迁移作用。结果示：对照组MSC细胞迁移数目（21.5 ± 2.4）低于MCP-1 5 ng/mL（26.2 ± 2.8，t=3.092, P=0.011）、50 ng/mL（35.5 ± 4.1，t=7.214,P=0.000）、500 ng/mL（55.3 ± 4.8，t=15.293, P=0.000）组（图3）。为验证MCP-1对MSC趋化迁移的特异性，480 ?滋g/mL 抗MCP-1多克隆抗体及5 ng/mL MCP-1加到趋化板的下层，观察趋化因子抗体对趋化迁移的对抗作用。实验结果显示：抗MCP-1多克隆抗体可对抗MCP-1对MSC的迁移作用，单纯DMEM组（21.0 ± 2.4）与加抗体组（21.2 ± 2.6，t=0.113, P=0.912）无统计学差异。

　　2.4  趋化因子MCP-1的免疫组化和Real-time PCR检测      　　正常对照组及假手术组趋化因子MCP-1免疫组化结果示：脊髓（T9-11）中部分细胞呈MCP-1阳性，阳性反应物主要分布在细胞胞浆，阳性细胞排列规律，两者染色未见差异；脊髓损伤后，损伤区阳性细胞形态不一，排列无规律，免疫染色较对照组及假手术组深。鉴于脊髓损伤后免疫阳性细胞形态、分布无规律性及着色与对照组和假手术组的差异，影响对MCP-1的定量，我们以Real-time PCR方法定量MCP-1变化，结果示：脊髓损伤后趋化因子MCP-1RNA在1 d、3 d及1周较对正常对照组有明显统计学差异（P < 0.05），第3天达高峰，2周时MCP-1量恢复到正常水平(图4)。

　　2.5  MSC体内迁移情况的观察      　　经颈内静脉注射MSC 2周后，对照组脊髓切片未见或偶见CFDA-SE荧光标记细胞（图5），实验组大鼠脊髓切片可见散在荧光标记MSC（图5）。正常对照组细胞迁移数（2.4 ± 1.4）低于脊髓全横断组（22.3 ± 3.4，t=16.223, P=0.000）。

　　3  讨论

　　3.1  MCP-1体外趋化MSC迁移      　　趋化因子(Chemokine)是指具有趋化作用的细胞因子，根据靠近分子氨基端(N端)的前两个C间是否插入其它氨基酸,将它们分为4个亚类：α、β、γ及δ类趋化因子。MCP-1属于β类趋化因子,它通过与其表面受体CCR2特异性结合,发挥作用。在正常神经系统MCP-1量维持在较低水平，不发挥迁移趋化作用，主要由星形胶质细胞，小胶质细胞和神经元表达[10]。当中枢神经系统或外周神经系统受损伤或缺血时，可引起MCP-1水平的上调，趋化血液系统中的单核/巨噬细胞向损伤区迁移并发挥相应生物学效应[10]。MCP-1在中枢神经系统疾病中起着双重作用:一方面,在病理状态下组织分泌的MCP-1可以诱导单核/巨噬细胞到受损部分,参与组织修复,是机体防御的重要组成部分；另一方面,组织局部产生的大量MCP-1又可引起过度的炎症反应,从而进一步加重组织损伤。      　　近来，研究表明：MSC具有体内迁移特性，但目前关于其迁移的具体机制还不清楚[4，5]。为探讨MSC的迁移机制，本研究首先通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法证实MSC表达趋化因子受体CCR2，然后通过Boyden小室法证实趋化因子MCP-1（5 ～ 500 ng/mL）体外可趋化MSC迁移，其趋化作用与浓度成正相关；同时，我们还观察到抗MCP-1多克隆抗体可对抗MCP-1的趋化迁移作用，这从侧面证实了趋化因子MCP-1对 MSC体外趋化迁移的特异性。

　　3.2   MCP-1/CCR2通路参与MSC向脊髓全横断损伤区迁移      　　为探讨MCP-1/CCR2通路是否参与MSC向脊髓全横断损伤区迁移，在以上体外实验基础上，我们建立脊髓全横断损伤模型，利用Real-time PCR方法证实：脊髓损伤后趋化因子MCP-1 RNA在1 d、3 d及1周较对照组有明显统计学差异，第3天达高峰，2周时MCP-1恢复到正常水平；同时，为观察MSC体内迁移情况，我们经静脉注射MSC，观察到荧光标记MSC可向损伤脊髓的迁移，脊髓全横断组迁移细胞数高于正常对照组，考虑可能系损伤区升高的MCP-1趋化移植的MSC向损伤区迁移，但尚不能排除其他趋化因子及受体的参与。

MSC取材方便，可快速体外扩增，适合于自体移植，在中枢神经系统疾病中应用取得了良好的效果，因此深入研究MSC的特性，对提高其在中枢神经系统疾病中的应用具有重要的意义。尽管本研究对了解MSC体内、外迁移提供了相关数据，但关于脊髓损伤后其他趋化因子的变化及趋化因子对MSC的趋化迁移作用尚需进一步研究。

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