脑胶质瘤组织培养化疗药物敏感性的研究

　　作者：张伟　江涛　袁芳　李桂林　董丽萍　徐立新　　作者单位：首都医科大学 北京市神经外科研究所， 北京天坛医院胶质瘤治疗中心， 北京 100050

　　【摘要】目的 建立脑胶质瘤的组织培养药敏检测法，用于筛选化疗药物及指导临床个体化化疗。 方法 应用组织培养药敏检测法对69例人脑胶质瘤标本进行化疗药物敏感性测定，所测药物为脑肿瘤常用化疗药物顺铂 (DDP)、长春新碱 (VCR)、替尼泊甙 (VM26)、尼莫司汀 (ACNU)、替莫唑胺 (TMZ) 及DDP+VM26组合。比较6组化疗药物体外抗肿瘤作用的差异，并分析药物敏感性与病人临床资料之间的相关性。 结果 DDP+VM26组合用药的敏感性与VM26单独用药比较，差异无统计学意义，但明显优于其他4种单药。病人性别、年龄、肿瘤初发或复发均对药物敏感性无显著性影响;除组合用药DDP+VM26外，其他药物的敏感性与病理分级无显著相关性。 结论 胶质瘤标本不同个体对同一药物及同一个体对不同药物的敏感性差异很大，脑胶质瘤化疗应优先选择以VM26为主的联合用药。

　　【关键词】 神经胶质瘤　药物筛选试验　抗肿瘤 组织培养

　　In vitro chemosensitivity test of glioma cells in tissue culture

　　ZHANG Wei, JIANG Tao, YUAN Fang, et al

　　Beijing Neurosurgical Institute; Glioma Center, Beijing Tiantan Hospital, Capital University of Medical Sciences,

　　Beijing 100050, China

　　Abstract: Objective To select chemotherapeutic agents for guiding tailor-made chemotherapy by chemosensitivity test of glioma cells in tissue culture. Methods Sixty-nine specimens of brain glioma were used to evaluate the chemosensitivity of glioma cells by tissue culture in vitro. The chemotherapeutic agents tested for brain cancer were cisplatin (DDP), vincristine (VCR), teniposide (VM26), nimustine (ACNU), temozolomide (TMZ) and DDP+VM26 group. The antineoplastic effects of these agents were compared, and the correlations between the chemosensitivity and patient characteristics were analyzed. Results There was no significant difference in the chemosensitivity between of DDP+VM26 and VM26 alone, but both of them were significantly higher than the other four groups. There was no significant influence of patients' sex and age and oncogenesis or relapse of the tumors on chemosensitivity. Except DDP+VM26 group, the other drugs showed no significant correlation of chemosensitivity with the pathological grade of the tumor. Conclusion In vitro chemosensitivity of glioma varies with not only the individuals but also the chemotherapeutic agents, and combined agents containing VM26 are more effective for glioma treatment.

　　Key words: glioma; drug screening assays, antitumor; tissue culture

　　化疗药物种类繁多，实施化疗前了解不同病人对不同化疗药物的敏感和耐受，预先筛选临床化疗药物，对指导临床个体化化疗具有重要意义[1]。本研究应用组织培养药敏检测法比较脑胶质瘤5种常用化疗药物的体外抗肿瘤作用，并且分析了各种药物敏感性与病人临床资料之间的相关性，旨在为临床筛选化疗药物及制定化疗方案提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料 69例标本均来自2006年1月～9月北京天坛医院胶质瘤治疗中心收治的病人，术后病理诊断均为脑胶质细胞瘤。其中男47例，女22例;年龄14～71岁，平均 (41.6 ± 12.0) 岁;初发57例，复发12例。按照WHO中枢神经系统肿瘤分类标准：Ⅱ级34例，Ⅲ级13例，Ⅳ级22例。

　　1.2 试剂 标本除菌洗涤液为含双抗的无血清RPMI-1640培养液，青霉素和链霉素浓度均为100 U/ml。组织培养液为含10%小牛血清的RPMI-1640培养液。MTT溶液浓度为10 mg/ml，用生理盐水配制，滤膜过滤除菌后装瓶备用，4 ℃避光保存。

　　本研究选用以下化疗药物：顺铂 (DDP)、长春新碱 (VCR)、替尼泊甙 (VM26)、尼莫司汀 (ACNU)、替莫唑胺 (TMZ) 五种单药及DDP+VM26一种组合用药。所采用的药物浓度均为血浆峰浓度，配药溶剂均使用灭菌注射用水。

　　1.3 组织培养药敏检测法 本研究采用江苏先声药业有限公司开发的组织块培养-终点染色-计算机图像分析法 (tissue culture-end point staining-computer image analysis，TECIA)，依据梁永钜等[2]报道的方法稍加修改，具体过程如下：

　　活组织标本为手术当日切除的新鲜无污染标本。术中选择坏死较少的部分肿瘤组织，立即放入培养液中并送实验室，4 h内在超净工作台进行实验。准备灭菌的24孔培养板，每孔放入一张灭菌滤纸，加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养液300 μl。用含有双抗的无血清RPMI-1640培养液清洗标本3次，洗去组织表面的血液，并剔除血管和坏死成分，将标本切割成1 mm3大小的组织块后，放入上述的24孔培养板中，每孔放1块。培养板放入37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。

　　第2天取出24孔培养板，用TECIA图像分析系统测定组织块面积，即初始面积 (area，A)。然后每孔加入化疗药物3 μl (对照孔除外)，69例标本均选择5种单药，其中45例增加组合用药DDP+VM26。化疗药物与培养液充分混匀后，放入培养箱孵育72 h。

　　第5天取出24孔培养板，每孔组织块上滴加10 μl MTT溶液，放入培养箱继续孵育。4 h后用TECIA图像分析系统测定组织蓝染面积 (blue area，BA)，TECIA分析软件计算化疗药物抑制率 (IR) = (1-BA处理 × A对照/A处理 × BA对照) × 100%。

　　化疗药物敏感性以抑制率作为评价标准，参照Singh等[3]的研究，抑制率在30%以上为敏感，低于30%为耐药。

　　1.4 统计学方法 应用SPSS 11.5 for Windows统计软件。脑胶质瘤标本对各种药物敏感性的比较，性别、年龄、病理分级、初发或复发与各种药物敏感性的相关性分析均采用χ2检验，以P <0.05判定为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 化疗药物敏感性的比较 DDP+VM26组合用药的敏感比例最高，为33.3%;其次是VM26，为27.5%;VCR的敏感比例最低，为8.7%。经χ2检验，各组用药敏感性间差异具有统计学意义 (χ2 = 20.045，P = 0.001);进一步两两比较，DDP+VM26组合用药的敏感性与VM26单独用药的敏感性差异无统计学意义，但明显优于其他四种单药。

　　2.2 性别与各种药物敏感性的关系 (表1) 以男、女性别与各种药物敏感性进行比较，统计结果显示：性别与各种药物敏感性之间无显著相关性 (P >0.05)。

　　2.3 年龄与各种药物敏感性的关系 (表2) 将69例病人分为<40岁和≥40岁两组，与各种药物的敏感性进行比较，统计结果显示：年龄与各种药物敏感性之间无显著相关性 (P >0.05)。

　　2.4 病理分级与各种药物敏感性的关系 (表3) 依据WHO胶质瘤分类标准，对肿瘤恶性程度进行分级，并与各种药物的敏感性进行比较，经χ2检验，仅组合用药DDP+VM26组的药物敏感性与病理分级有关 (P <0.05)，其他五种单药敏感性与病理分级无相关性。

　　2.5 肿瘤初发、复发与各种药物敏感性的关系 (表4)

　　将69例病人分为初发和复发两组，与各种药物的敏感性进行比较，统计结果显示，肿瘤初发或复发与各种药物敏感性之间无相关性 (P >0.05)。

　　3 讨论

　　目前常见的体外药物敏感试验主要分为以下几类：①人体肿瘤细胞集落测定法 (Human Tumor Cloning Assay，HTCA)。②快速原代培养细胞毒性试验，如区别染色细胞毒性试验 (Differential Staining Cytotoxicity Assay，DiSC)、四氮唑盐比色法 (Methylthiazolyl tetrazolium，MTT法)、三磷酸腺苷生物发光法 (ATP- tumor chemosensitivity assay，ATP-TCA) 等。③放射性标记核酸前体掺入法 (3HTdR)。④细胞团及组织块培养法，如胶原凝胶液滴植入培养法 (collagen gel droplet embedded culture drug sensitivity test，CD-DST)、立体组织培养法 (Histoculture Drug Response Assay，HDRA) 等。

　　HDRA法是一种基于非分散性组织的药敏检测技术，该技术将微小的组织块培养于海绵状胶原凝胶基质上，同时加入抗癌药物作用一定时间，细胞活性终点评价采用MTT还原法。由于单细胞的体外生存环境与体内实体瘤中的环境差别很大，组织培养法与单细胞法相比，能够保持实体瘤在体内的三维生长方式、组织结构、细胞异质性和致瘤性等多种特性，并能模拟体内实体瘤细胞的环境，提高药敏检测的准确性，是一种较实用的微量化体外药敏检测方法，具有很好的临床应用前景。研究证明：该药敏检测法的结果和临床效果的相关率达到92.1%[4]。随后HDRA法被广泛用于多种实体瘤化疗的研究，如胃肠癌、泌尿系肿瘤、乳腺癌、头颈部肿瘤、口腔癌等，均取得了良好的效果。本研究基于上述HDRA法原理采用的组织培养药敏检测法，应用图像分析技术，检测了69例脑胶质瘤标本的化疗药物敏感性，发现不同个体对同一药物及同一个体对不同药物的敏感性差异较大，抑制率最高达87.6%，最低为0。

　　本研究所选的5种药物均为目前临床上治疗恶性脑肿瘤常用的化疗药物，研究结果显示：DDP+VM26组合用药的敏感率最高 (33.3%)，其次是VM26 (27.5%)，两者敏感性无显著性差异，但明显优于其他四种单药DDP (11.6%)、VCR (8.7%)、ACNU (11.6%) 和TMZ (15.9%)。该结果与国内学者姜曙等[5]、张俊英等[6]和于朝春等[7]应用MTT法 (单细胞法) 进行的脑胶质瘤体外药敏检测结果相似。VM26为鬼臼毒素衍生物，属于拓扑异构酶抑制剂，脑胶质瘤体外药敏试验中抑瘤作用较强，这与目前临床上选择以VM26为主的联合用药治疗胶质瘤取得较好的疗效相一致。TMZ是一个新型的广谱抗肿瘤烷化剂，口服吸收，易于通过血脑屏障，其脑脊液/血浆药物浓度比接近30%～40%，这些特性使其成为近年来治疗恶性脑胶质瘤的重要化疗药物[8，9]。本研究将TMZ引入脑胶质瘤的体外药敏试验，结果显示：TMZ的敏感率为15.9%，与Bower等[10]报道的临床有效率 (11%) 相近，其临床应用效果还需进一步观察。

　　目前临床上胶质瘤的化疗方法多为经验性化疗，主要依据病人的临床情况及文献报道。本研究进一步对可能影响药敏检测结果的病人临床因素，如性别、年龄、病理分级、肿瘤初发或复发等进行了相关性分析，发现仅组合用药DDP+VM26的敏感性与病理分级有关，其他药物的敏感性与病理分级无明显相关;而且性别、年龄、肿瘤初发或复发均对药物敏感性无明显影响。Stewart等[11]对恶性胶质瘤化疗效果进行Meta分析也得到了相似的结论。他们收集了全世界12个恶性胶质瘤化疗的随机对照研究 (3 004例病人) 发现脑胶质瘤的化疗效果与年龄、性别、组织类型、机能状态和手术切除范围均无相关性。因此，临床上为脑胶质瘤病人制定个体化的化疗方案时，不能仅将性别、年龄、病理分级、肿瘤初发或复发等因素作为参考内容，还需要了解病人对化疗药物敏感或耐受的客观指标。

　　目前对于胶质瘤的耐药机制尚未完全明了，普遍认为是多因素、多基因共同参与的一个复杂过程。由于尚不明确某一单一因素或基因决定胶质瘤对化疗药物的敏感性，同时临床亦上难以检测所有耐药相关基因的表达情况，因此能够直接和客观地反映肿瘤组织对化疗药物的敏感和耐受的肿瘤体外药敏试验，具有一定的参考意义，可以为临床制定化疗方案提供一定的帮助。

　　肿瘤的体外药敏试验已有数十年的历史，大量研究[12]表明：体外药敏检测与临床疗效存在良好相关性，一般化疗药物的体外敏感与体内有效的符合率为50～70%，体外耐药与体内无效的符合率为85～95%[13]。由于药物在体外与体内的作用条件不同，体外试验不能完全模拟体内作用的复杂过程，体外药敏检测为敏感的药物，在体内并不一定有效。如果药物在体外均不能抑制肿瘤组织生长，其在体内的作用效果必然不理想。然而，药敏试验指导的化疗与经验性化疗孰优孰劣仍需要大样本的前瞻性随机临床研究来进一步验证。

　　随着我们对脑胶质瘤分子病理学特征及其耐药机制的逐步认识，根据体外药敏的检测结果和耐药相关基因的表达情况，对脑胶质瘤的化疗方案进行综合考虑，对于指导临床脑胶质瘤的个体化化疗具有重要价值。

　　【参考文献】

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