人脑胶质瘤中Cx43mRNA及其蛋白的表达意义

　　作者：宋国智,焦保华,李利敏,马文群,阚敏宸　　作者单位：056001 河北省邯郸市中心医院神经外三科(宋国智、李利敏、马文群、阚敏宸);河北医科大学第二医院神经外科(焦保华);河北省邯郸市丛台区卫生局(陈延平);河北省邯郸市第一医院(刘运芳)

　　【摘要】 目的 探讨Cx43基因表达与胶质瘤恶性程度的关系。方法 采用免疫组化及原位杂交技术检测Cx43基因的表达。结果 Cx43mRNA及其蛋白表达随着胶质瘤组织学分级的提高呈下降趋势，Cx43蛋白表达结果与Cx43mRNA的表达结果之间呈显著正相关(P<0.05)。人脑胶质瘤中Cx43mRNA及蛋白表达与肿瘤分级呈负相关。结论 Cx43基因表达与胶质瘤恶性进展密切相关。

　　【关键词】 胶质瘤 间隙连接蛋白 免疫组织化学 原位杂交

　　胶质瘤是颅内常见的恶性肿瘤，发病率较高，手术难以做到彻底切除，且恶性程度有增加趋势。作为抑制肿瘤细胞生长的抑癌基因Cx43已得到众多学者的认同。该基因的表达上调,能抑制肿瘤细胞生长。我们利用免疫组化技术检测Cx43蛋白和原位分子杂交技术检测Cx43mRNA在胶质瘤中的表达，分析Cx43基因表达与胶质瘤恶性程度的关系，探讨Cx43基因的表达与胶质瘤发生机制，为胶质瘤恶性程度、术后的治疗以及疗效观察提供客观的依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 标本均取自河北省邯郸市中心医院神经外科2006～2007年手术切除的胶质瘤标本47例(实验组)和正常脑组织标本10例(对照组)。按1999年WHO脑肿瘤分类标准分类：Ⅰ级7例;Ⅱ级16例;Ⅲ级18例;Ⅳ级6例。47例标本，均用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于免疫组化，原位杂交。

　　1.2 主要试剂及溶液 鼠抗人Cx43单抗和Cx43mRNA原位杂交检测试剂盒(地高辛标记)购自武汉博士德生物工程有限公司。PV6000通用型试剂盒、DAB显色试剂盒和柠檬酸盐抗原修复液购自北京中杉试剂公司。

　　1.3 实验方法 本实验要求对正常脑组织及恶度肿瘤的Cx43基因进行定位检测，采用免疫组化及原位杂交技术检测Cx43基因的表达,以观察连接蛋白(Cx)基因是否表达(mRNA，蛋白质)，在正常脑组织及恶度肿瘤中的表达部位及相互关系。

　　1.3.1 原位杂交检测Cx43mRNA：石蜡切片常规脱蜡至水，3% H2O2封闭灭活内源性过氧化酶活性，暴露mRNA核酸片段，切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，原位杂交用PBS洗滴后固定。预杂交：每张切片加20 μl预杂交液。杂交：每张切片加20 μl杂交液，滴加封闭液，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC，滴加生物素化过氧化物酶，DAB显色，苏木精复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片。

　　1.3.2 Cx43免疫组化技术检测：用SP法检测Cx43，灭活内源性过氧化酶活性，微波修复抗原，滴加鼠抗人Cx43单抗50 μl，4℃湿盒中过夜，滴加生物素标记的第二抗体50 μl，滴加SP复合物。显色：PBS 4 ml、DAB 5 g、H2O25 μl，至显色满意后冲洗，终止显色反应，苏木素复染。酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶固封，显微镜检。

　　1.4 染色结果的观察和判定标准

　　1.4.1 Cx43蛋白表达阳性标准：Cx43阳性表现为肿瘤细胞膜和细胞浆呈棕黄色，以胞质染上棕黄色为阳性。随机选择10个高倍视野(10×400)，计算瘤细胞中阳性染色细胞数及染色强度，计算阳性细胞所占百分比。阳性细胞数<10%为(-)染色强度无，阳性细胞数10%～30%为(+)染色强度弱(淡黄)，31%～60%为(++)染色强度中(棕黄)，>60%为(+++)染色强度强(棕褐)。

　　1.4.2 Cx43mRNA原位杂交评价标准：Cx43mRNA阳性表现为以胞浆内出现黄色颗粒为阳性。原位杂交阳性评分标准同免疫组织化学中Cx43蛋白的表达阳性标准。原位杂交：强阳性反应(+++)为棕褐色;中等阳性反应(++)为棕黄色;阳性反应(+)为浅黄色;阴性反应(-)为着色与背景色相同。

　　1.5 统计学分析 数据分析采用SPSS 11.0统计软件包，对Cx43基因和PCNA蛋白在正常脑组织和各级胶质瘤中的表达的差异与相关性，采用χ2关联检验、秩和检验及Spersman等级相关分析进行处理，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　正常脑组织中Cx43mRNA表达阳性率为100%，而47例胶质瘤中Cx43mRNA表达阳性率为61.7%(表1)，实验组明显高于对照组(P<0.01)，说明Cx43mRNA在胶质瘤中的表达较正常脑组织低。不同级别的胶质瘤中Cx43mRNA的表达不同，低恶度胶质瘤组织(WHOⅠ～Ⅱ级)中表达率分别为100.0%，93.8%;高恶度胶质瘤(WHO Ⅲ～Ⅳ)表达率分别为33.3%，16.7%(表2，图1)，恶性程度越高，其表达越低，其表达阳性率和表达水平均随肿瘤恶性程度增加而明显下降，2组比较，低恶度肿瘤与高恶度肿瘤差异有统计学意义(P<0.01)。胶质瘤Cx43mRNA表达率均与胶质瘤分级呈负相关(r=0.581，P<0.05)。Cx43蛋白在正常脑组织和胶质瘤中表达情况与Cx43mRNA的表达情况基本一致(图2)。

　　表1 2组Cx43mRNA表达比较(略)

　　注：与对照组比较，3P<0.01

　　表2 不同级别胶质瘤组织Cx43mRNA表达比较(略)

　　注：与Ⅳ级比较，3P<0.01;与Ⅲ级比较，#P<0.01;与Ⅱ级比较，△P<0.01

　　A：正常脑组织中高表达 原位杂交(×400);B：胶质瘤Ⅰ/Ⅱ级中表达下降 原位杂交(×400);C：胶质瘤Ⅲ级中低表达 原位杂交(×400);D：胶质瘤Ⅳ级中阴性表达 原位杂交(×400)

　　图1 Cx43mRNA在不同级别胶质瘤及正常脑组织中的表达(略)

　　Cx43蛋白表达阳性率和表达水平均与Cx43mRNA的表达呈正相关(r=0.9630，P<0.01)，表明随肿瘤恶性程度增加，Cx43 mRNA转录水平逐渐降低，导致翻译水平下降，Cx43蛋白在脑组织中的含量也降低见，见表3。

　　表3 Cx43mRNA和Cx43蛋白在胶质瘤组织中的表达比较(略)

　　注：与CX43蛋白相关性比较，3P<0.01

　　A：正常脑组织中高表达 原位杂交(×400);B：胶质瘤Ⅰ/Ⅱ级中表达下降 原位杂交(×400);C：胶质瘤Ⅲ级中低表达 原位杂交(×400);D：胶质瘤Ⅳ级中阴性表达 原位杂交(×400)

　　图2 Cx43蛋白在不同级别胶质瘤及正常脑组织中的表达(略)

　　3 讨论

　　Cx基因家族编码的蛋白是构成介导细胞间通讯的间隙连接(gapjunction, GJ)的基本结构和功能单位[1]。在许多肿瘤中，Cx基因表达下降或缺失，细胞间隙连接通讯(GJ1C)中断。Cx基因家族的某些成员具有抑制细胞生长，使单个细胞生长与毗邻细胞相协调，表现出肿瘤抑制基因的特点，被认为是一个肿瘤抑制基因家族。

　　间隙连接介导的GJIC是相邻细胞之间直接通讯的唯一方式。间隙连接是由两个相邻细胞膜上各自一个连接子相互连接形成的跨膜蛋白通道。每个连接子，其在胞膜上形成双跨膜“M”形分子，胞外两个结构域高度保守，这种保守性是连接子相互衔接形成通道的基础，保证了细胞间信号的传递;胞浆内的结构域差别很大，因此形成了Cx家族的多个成员。成人脑组织中主要表达Cx32和Cx43，其中星形细胞表达Cx43，少枝胶质细胞及某些神经元表达Cx32，少数细胞如松果体细胞表达Cx26，软膜细胞及室管膜细胞除表达Cx43外亦可表达Cx26。

　　Cx43由跨度为2768bp的DNA所编码，该cDNA含有一1146bp的开放读码框，因编码分子量为43 kDa的含有378个氨基酸的单肽，故得名。相邻细胞通过间隙连接，进行着信息和能量物质的交换，对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化起着重要的调控作用。在胚胎发育早期，它们对胚胎组织的生长控制、形态发生及分化起重要作用[2]。在电兴奋组织如心肌，间隙连接为细胞间提供了低电阻导电途径，对维持这些细胞特化的功能如心肌节律性同步收缩起着重要作用[3]。结构和功能完整的细胞间隙连接对维持正常细胞生长、增殖和分化起重要作用。

　　根据Wilgenbus等[4]研究正常组织和肿瘤组织中Cx蛋白的表达情况发现，在正常组织中表达的Cx在其肿瘤组织中表达显著下降，当Cx基因表达下降或消失时，GJIC的功能可能减弱至消失，于是细胞过度增生甚至癌变，提示Cx对肿瘤有抑制作用，所以Cx基因被认为是抑癌基因。Lee等[5]认为Cx是一种II型抑癌基因—非突变型抑癌基因。因为CX基因本身无突变或丢失，有的只是转录、转录后、翻译和翻译后水平的变化。Cx基因的表达对绝大多数肿瘤细胞的生长起负性调控作用，其证据有：(1)恶性转化细胞普遍存在Cx基因表达下调、缺陷和GJIC功能缺陷;(2)多种肿瘤促进剂通过抑制Cx基因表达诱发癌变;(3)Cx基因转染抑制恶性肿瘤的生物学行为。Hirschi等[6]对乳腺癌的研究结果说明，Cx43蛋白表达和GJIC功能异常可促进癌细胞转移。Cx43基因的作用机理是复杂的，可能既有赖于调节GJIC,又可能以不依赖于GJIC的方式而调控细胞生长。但在抑制肿瘤生长中，Cx43基因和GJIC以及其它细胞周期调控基因的相互作用尚待深入研究。

　　近年来的研究发现Cx43表达的减少或缺失与神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、子宫颈癌等多种肿瘤的发生发展密切相关[7，8]。Cx43在正常胃黏膜及喉黏膜上皮细胞膜中高水平表达，而在胃癌和喉癌细胞中表达减少或缺失，并且多位于细胞浆内。Laird等[8]等对乳腺癌标本Cx43表达进行检测，发现Cx43为正常乳腺组织中主要的间隙Cx，而在原位癌和浸润癌中未见其表达，Cx43缺乏是人类乳腺癌组织的共同特征。

　　在神经系统肿瘤研究中，Northern杂交发现C6鼠胶质瘤细胞Cx43mRNA表达水平明显下降，免疫组化检测不到Cx43表达，GJIC功能下降。Shinoura等[9]检测16例人脑胶质瘤，Northern印迹表明除1例胶质母细胞瘤表达缺失外，其余肿瘤均有Cx43mRNA表达，但表达水平差异很大。恶性胶质瘤既可高表达又可低表达。免疫组化和免疫印迹显示肿瘤Cx43表达与Cx43 mRNA表达水平相一致。Huang等[10]用Western印迹和RT2PCR法检测5例人胶质母细胞瘤，发现Cx43表达水平均明显下降。上述结果初步显示：人脑胶质瘤Cx基因及其编码蛋白表达，同其它许多恶性肿瘤一样，可下降或缺失。Cx43的变化不是脑胶质瘤的始动因素，据此认为它的表达下降可能使胶质瘤由低恶度向高恶度进展或使肿瘤更具侵袭性。Cx43不仅在星形细胞瘤中有表达，还可在少枝胶质细胞瘤、神经节胶质细胞瘤、脑膜瘤及髓母细胞瘤中表达。说明在肿瘤发生发展中细胞失分化。总之，Cx基因及其编码蛋白在神经系统肿瘤，尤其在各级胶质瘤中有广泛表达，但其表达水平及其变化规律尚待进一步深入研究。

　　本实验对47例人脑胶质瘤和10例正常脑组织采用免疫组化检测Cx43基因表达，结果表明：正常脑组织均高表达Cx43基因。低恶度胶质瘤组织(WHO Ⅰ～Ⅱ级)中Cx43mRNA表达率分别为100.0%(7/7)，93.5%(15/16);高恶度胶质瘤(WHO Ⅲ～Ⅳ)Cx43表达率分别为33.3%(6/18)，16.7%(1/6)，恶性程度越高，其表达越低，表达阳性率和表达水平均随肿瘤恶性程度增加而明显下降，说明随着组织学分级升高Cx43表达呈下降趋势，2组比较，低恶度肿瘤与高恶度肿瘤差异有统计学意义(P<0.01)。胶质瘤Cx43蛋白表达率均与胶质瘤分级呈负相关(P<0.05)，胶质瘤恶性程度越高，Cx43蛋白表达水平越低。Huang等[11]用免疫组化回顾性地检测18例人脑胶质瘤标本，结果Ⅰ/Ⅱ级4例Cx43表达水平高、Ⅲ级8例表达水平低或缺失、Ⅳ级6例均表达缺失，提示Cx43表达与胶质瘤病理类型及恶性程度有关。其结果与我们的相似，初步揭示了Cx43基因在各类人脑胶质瘤中的表达规律。

　　进一步分析实验结果,我们发现用免疫组织化学法检测Cx43表达阳性率和表达水平均与Cx43mRNA的表达结果之间呈正相关(P<0.01)，表明随肿瘤恶性程度增加，Cx43mRNA转录水平逐渐降低，导致翻译水平下降，Cx43在脑组织中的含量也降低。统计分析表明Cx43mRNA及其蛋白与胶质瘤的恶性程度呈负相关性(P<0.05)。

　　我们认为，在恶性程度低的胶质瘤中，Cx43蛋白高表达阻止了细胞由G1到S期转化，致使进入S期的瘤细胞减少，而在恶性程度高的胶质瘤中情况则相反。而当Cx43基因降低时，各种周期蛋白的活性增高，使损伤的DNA 顺利通过细胞周期G1 期的后期而进入S 期，DNA 开始大量合成，均可导致细胞无限增殖和凋亡抑制，并进而使低度恶性肿瘤向高度恶性肿瘤转化。总之，我们的研究表明Cx43mRNA及其蛋白的表达与胶质瘤的分化程度有关。在脑胶质瘤中随着恶性程度的升高，Cx43mRNA及其蛋白表达下调，提示在G1/S期可能通过一定机制协同调节细胞增殖周期进程，导致肿瘤细胞增殖活性的改变。深入研究Cx43mRNA及其蛋白在脑胶质瘤的发生，将为脑胶质瘤的治疗提供新的思路。间隙连接蛋白Cx43表达下降可能与多种致癌因素共同参与了胶质瘤的发生，对Cx43的研究将为全面正确地揭示胶质瘤的发生发展提供一个新的佐证。

　　【参考文献】

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　　3 Naus CCG,Zhu D,Todd SDL,et al.Characteristics of c6 glioma cells overexpressing a gap junction protein.Cell Mol Neurobiol,1992,12:1632175.

　　4 Wilgenbus KK,Kirkpatrick CJ,knueche LR,et al.Expression of Cx26,Cx23,Cx43 gap junction proteins in normal and neoplastic human tissues.Int J Cancer,1992,51:5222529.

　　5 Lee SW,Tomasetto C,Sager R.Positive selection of candidate tumor suppressor genes by subtractive hybridization.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:282522829.

　　6 Hirschi KK，Xu CG,Tsukamoto T,et al.Gap junction genes Cx26 and Cx43 individually suppress the cancer phenotype of human mammary caicinomacells and restore differentiation potential.Cell Growth Differ，1996,7:861.

　　7 Huang RP,Hossain MZ，Sehgal A，et al. Reduced connexin 43 expression in high2grade human brain gliome cells.J Surg Oncel，1999,70:21.

　　8 Laird DK，Fisturis P,Batist G，et al.Deficiency of connexin 43 gap junctions is an independent marker for breast tumors. Cancer Res,1999，59:4104.

　　9 Shinoura N,Chen L,Wani MA,et al.Protein and messenger RNA expression of connexin43 in astrocytomas:implications in brain tumor gene therapy.J Neurosurg,1996,84:8392846.

　　10 Huang RP,Fan Y，Hossain MZ,et al.Reversion of the neoplastic phenotype of human glioblastotma cells by connexin 43 (Ca43).Cancer Research,1998,58:508925096.

　　11 Huang RP，Hossain MZ，Sehgal A，et al.Reduced connexin 43 expression in high2grade human brain gliome cells.J Surg Oncel，1999,70:21.