重组腺病毒p53上调凋亡调控因子通过凋亡通路增强胶质瘤细胞对替莫唑胺敏感性的体外研究

　　作者：刘晓东　王宏勤　苗旺　赵和千　范益民　郝解贺 作者单位：030001　太原，山西医科大学附属第一医院神经外科

　　【摘要】 目的　探讨转染p53上调凋亡调控因子(PUMA)的人脑胶质瘤细胞对替莫唑胺敏感性增强的作用机制。方法　将人脑胶质瘤细胞U87MG分为正常对照组、空载体组和实验组进行培养，分别将感染复数(MOI)=50的空载体腺病毒(Ad-△BH3)和携带PUMA的重组腺病毒(Ad-PUMA)转染U87MG细胞，转染后用MTT 比色法测定各组细胞的存活率并计算替莫唑胺(TMZ)IC50，流式细胞仪检测细胞周期的变化，应用TUNEL法检测细胞的凋亡情况。Western blot 检测凋亡相关蛋白p53、Bax的表达。结果　外源性 PUMA 基因在Ad-PUMA转染U87MG 48 h后，随着时间延长，PUMA表达使U87MG细胞的增殖能力降低并诱导凋亡，转染 24 h、48 h、72 h 的生长抑制率分别为 17.3%、35.6%、43.3%，凋亡率分别为20.3%、31.4%、45.4%。正常对照组、Ad-PUMA、Ad-△BH3组细胞的TMZ IC50分别为 (15.0±1.9)μmol/L、(2.3±0.1)μmol/L和 (14.4±1.6)μmol/L。PUMA表达的U87MG细胞 DNA合成受到抑制，周期阻滞在G2期;Western blot 检测显示p53表达在各组中差异无统计学意义(P>0.05)、PUMA和Bax在实验组中表达较对照组强，差异有统计学意义(P<0.01)。结论　Ad-PUMA转染可有效增强人脑胶质瘤细胞U87MG对TMZ的敏感性，抑制人脑胶质瘤细胞U87MG的增殖，通过诱导细胞G2期阻滞促进其凋亡，促凋亡机制不依赖于p53。

　　【关键词】 神经胶质瘤;　细胞凋亡;　PUMA基因;　替莫唑胺;　重组腺病毒

　　【Abstract】　Objective　To investigate the effect of PUMA on the sensitivity of human glioblastoma U87MG cells to temozolomide and its related mechanisms.Methods　U87MG cells under culture were divided into the normal control group，mock group and experiment group.After 24 hours of culture，the mock and experiment group were transfected with mock vector (Ad-△BH3) and the recombinant adenovirus carrying PUMA(Ad-PUMA)respectively at a multiplication of infection (MOI) of 50.The proliferation activity of cells and IC50 were detected by MTT assay，the apoptosis effect and the change of cell cycle determined by Hoechst stain and flow cytometry (FCM) technology respectively.The expression of related proteins was revealed by the method of Western blot.Results　Exotic PUMA gene was expressed in U87MG cells transfected with Ad-PUMA，which could inhibit the proliferation of U87MG cells.The inhibition rate of proliferation 24,48,72 h after transfection was 17.3%,35.6%,43.3% and apoptosis rate was 20.3%,31.4%,45.4% respectively.Results：The TMZ IC50 values of PBS group，Ad-PUMA and Ad-△BH3 group cells were (15±1.9)，(2.3±0.14) and (14.4±1.6)μmol/L respectively，with the sensitivity to the TMZ of Ad-PUMA group cells increased by 7.0 folds.PUMA overexpressing U87MG cells showed the DNAsynthesis was inhibited and arrested in G2 phrase.The results of Western blot showed that after 72 h of transfection the PUMA and Bax protein showed increased expression (P<0.01).There was no significant difference in the expression of p53 among these groups (P>0.05).Conclusions　PUMA gene transfection greatly enhances the sensitivity of U87MG cells to TMZ-induced apoptosis and can effectively inhibit the proliferation and promote the apoptosis of U87MG cells.The mechanism of apoptosis mainly relates to induce cell cycle G2 arrest and apoptosis in vitro.

　　【Key words】　Glioma;　Apoptosis;　PUMA gene;　Temozolomide;　Recombinant adenovirus

　　p53上调凋亡调控因子 ( p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA)是2001年发现的一种促凋亡蛋白，研究显示PUMA在化疗药物诱导肿瘤的凋亡过程中发挥作用[1]。我们的前期工作已经发现促凋亡基因PUMA在人脑胶质瘤细胞中低表达。本实验旨在通过体外实验，进一步研究外源性PUMA增强人脑胶质瘤细胞对胶质瘤一线化疗药物替莫唑胺(TMZ)敏感性及其分子机制，以期为胶质瘤基因治疗提供新的思路。

　　材料与方法

　　一、实验材料

　　人脑胶质瘤细胞株U87MG购自中科院上海细胞生物学研究所;PUMA基因序列由上海生工生物有限公司合成，Ad-PUMA应用LR体外重组法自行构建并鉴定构建成功，滴度为2.0×108 pfu/ml。四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 购自 Sigma 公司;Tunel试剂盒购自Cell Signaling Technology公司;兔抗人PUMA单克隆抗体(1∶300)、兔抗人p53单克隆抗体(1∶500)、兔抗人Bax单克隆抗体(1∶300)及过氧化物酶标记的羊抗兔抗体均购于美国Santa Cruz公司;低分子量蛋白Marker购于博美科公司;硝酸纤维素膜(NC膜)购于Sigma公司。TMZ原药由天津天士力惠赠。

　　二、实验方法

　　1. 细胞培养和基因转染：U87MG细胞在含10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养液，37 ℃、5%CO2、饱和湿度环境的条件下连续培养。转染前1 d，选择对数生长期U87MG细胞，将适当密度的细胞悬液接种于培养器皿中，培养过夜达60%～80%融合，按感染复数(MOI)=50进行转染。次日进行瞬时转染。实验分组：(1)对照组：只接种细胞，未转染质粒;(2)空载体对照组：转染Ad-△BH3;(3)实验组：转染Ad-PUMA。继续分别培养至24、48及72 h。

　　2. MTT比色法检测细胞增殖活性并测定：各组细胞分别接种于96孔(1×104/孔)培养板，24 h后每孔更换含系列浓度TMZ(0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L、160 μmol/L)的培养液100 μl。48 h后，96孔培养板各组的每1孔分别加入MTT溶液20 μl(终浓度5.0 mg/ml),37 ℃，继续孵育4 h，弃尽板中的培养液，加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，用酶标仪检测570 nm 波长处各孔的吸光度(OD)值。同时设置不加细胞的调零孔(培养基、MTT、DMSO)。以每组6个孔OD值-空白对照组OD值的平均值作为各组的平均OD值。细胞生长抑制率=[(1-转染组OD值)/细胞对照组OD值]×100%。以不同药物浓度的对数值为横坐标，细胞存活率为纵坐标，建立半对数回归方程，由回归方程求出半数抑制浓度(50%inhibition concentration，IC50)。

　　3. 流式细胞仪检测细胞周期变化：转染后24、48及72 h，从6 cm培养皿收集各组所有悬浮及贴壁细胞，离心去培养液，PBS洗涤 2次，加入1 ml 预冷的 70%乙醇4 ℃固定过夜后，离心去乙醇，加 20 μl RNaseA (1 mg/ml) 37 ℃水浴 30 min，再加入800 μl碘化丙碇(PI)(100 μg/ml)染色液混匀，至4 ℃ 避光30 min，流式细胞仪检测，记录激发波长488 nm 处的红色荧光。

　　4. TUNEL法测定Ad-PUMA诱导的肿瘤细胞的凋亡：离心重悬各组细胞，接种细胞于内置盖玻片的3.5 cm培养皿(1×108/皿),37 ℃温箱孵育24 h 后加入Ad-PUMA和Ad-△BH3继续孵育72 h，实验以加PBS做对照。采用TUNEL试剂盒，按试剂盒说明书操作，计算每高倍视野下凋亡细胞数，每一样本随机计数5个视野。

　　5. Western blot 检测PUMA、p53及Bax蛋白的表达：转染后24、48 及72 h 从10 cm培养皿收集各组细胞，分别提取蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。用RIPA裂解法提取未转染细胞总蛋白作为阳性对照。50 μg蛋白样品经SDS-PAGE电泳 (15%) 后电转移至硝酸纤维素膜(150 mA,2 h)，封闭液25 ℃ 振荡封闭2 h，再加一抗(PUMA 1∶300，p53 1∶500，Bax 1∶300，内参照β-actin 1∶200)4 ℃过夜，次日分别与二抗室温作用 2 h后 ECL荧光显影。

　　三、统计学分析

　　结果以均数±标准差(x-±s)表示，采用SPSS 13.0统计软件对结果进行单因素方差分析，两两比较采用q检验，检验水准取0.05。

　　结　　果

　　1. Ad-PUMA增强人脑胶质瘤细胞对TMZ的敏感性：通过 MTT法测定了人脑胶质瘤细胞U87MG对TMZ细胞毒作用的敏感性。结果发现，TMZ的浓度范围为0.1～160 μmol/L时细胞存活率与TMZ浓度之间存在剂量依赖性，随着TMZ浓度增高，细胞生存率逐渐下降;Ad-PUMA细胞与对照组和Ad-△BH3细胞比其生存率下降更为明显。计算得出，Ad-PUMA细胞IC50为(2.3±0.1)μmol/L，对照组和Ad-△BH3细胞 IC50分别为 (15.0±1.9)μmol/L和 (14.4±1.6)μmol/L。各组细胞对TMZ敏感度，Ad-PUMA组比对照组细胞高将近7倍。随着Ad-PUMA作用时间延长，U87MG细胞生长受到抑制(图1)，结果显示，Ad-PUMA可增加TMZ对U87MG作用的敏感性。

　　2. Ad-PUMA转染后对细胞凋亡的影响：转染48 h后进行TUNEL检测，正常对照组(PBS)未见转染病毒质粒(背景呈黑色)，空载体组(Ad-DsRed-△BH3)几乎看不到凋亡细胞(FITC呈绿色)，Ad-DsRed-PUMA组可以看到大量凋亡细胞(Merge后呈黄色)(图2)。

　　3. Ad-PUMA对U87MG细胞周期的影响：24 h Ad-PUMA感染组的S期/G2期细胞平均百分比与Ad-△BH3组和对照组无明显差别。72 h实验组S期/G2期细胞百分比明显高于Ad-△BH3组和对照组(图3)。

　　4. Western blot 分析相关蛋白的表达：实验组U87MG细胞经转染Ad-PUMA 72 h后，PUMA、Bax蛋白表达增强，p53蛋白表达无明显变化(图4)。

　　讨　　论

　　研究认为，某些癌细胞对放、化疗的耐受与细胞凋亡机制无法正常发挥作用密切相关[2]，PUMA作为新近发现的一个促凋亡因子，最早发现于结直肠癌细胞中。研究PUMA介导的细胞凋亡的分子机制时发现，PUMA通过其BH3结构域分别和 Bcl-2家族多种抗凋亡成员(如 Bcl-XL，Bcl-2等)产生广泛的相互作用，使原本结合于抗凋亡蛋白上的Bax解离并多聚化，进而转位激活线粒体依赖的内源性凋亡通路，诱导结肠癌细胞凋亡[3]。Gu等[4]研究发现，p53腺病毒介导的肺癌肿瘤细胞凋亡过程中，PUMA表达显著上调。王新颖等[5]发现在体外实验中，PUMA在大肠癌化疗药物奥沙利铂诱导大肠癌细胞凋亡过程中发挥重要作用。Wang等[6]用反义脂质体转染沉默PUMA后，顺铂诱导的直肠癌细胞凋亡受到抑制。近几年研究也发现胶质瘤的形成和发展与胶质瘤细胞凋亡与细胞增殖之间失衡有关，尤其凋亡异常导致胶质瘤对化疗耐药性[7-14]。

　　本实验利用携带PUMA的重组腺病毒转染人脑胶质瘤细胞U87MG，将外源性促凋亡基因PUMA转入胶质瘤细胞，进行一系列体外实验研究发现：转染PUMA的U87MG细胞对胶质瘤一线化疗药物TMZ敏感性增强，其实验组TMZ IC50值较对照组明显降低。随着转染时间推移，实验组细胞生长受到抑制，在转染后72 h，细胞开始出现明显的凋亡，对胶质瘤抑制作用逐渐增强。通过细胞周期检测发现实验组S期/G2期细胞相对比例明显升高，说明PUMA可能通过G2期阻滞作用抑制胶质瘤生长，改变胶质瘤细胞周期进程，促发胶质瘤细胞凋亡程序启动。

　　本实验发现转染PUMA 的胶质瘤细胞，PUMA 、Bax表达增强，p53表达没有变化，说明PUMA导致细胞凋亡的机制可能是通过促进Bax高表达发挥促凋亡作用，而这个过程与p53关系甚微。Ito等[15]研究也发现，不论p53状态如何，PUMA表达与肿瘤细胞凋亡直接相关，PUMA过表达可导致所有实验细胞大量凋亡，并伴随线粒体损伤和 caspase活化。Yu等[16]用Ad-PUMA分别与紫杉醇、氟尿嘧啶、顺铂、依托泊苷等联合处理人肺腺瘤A549细胞，结果显示，Ad-PUMA可以增加 A549细胞对常见化疗药物和放疗的敏感性。Ad-PUMA似乎对癌细胞具有选择性毒性，而且在抑制癌细胞生长方面比p53更有效。

　　总之，本研究验证了Ad-PUMA可以增强人脑胶质瘤细胞对化疗药TMZ的敏感性，并对相关凋亡因子进行了检测，为进一步研究Ad-PUMA促进胶质瘤细胞凋亡的作用机制奠定了基础，为胶质瘤耐药研究开辟了新的途径。

　　(本文图片见光盘)

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