白介素-6拮抗N-甲基-D-天门冬氨酸诱导的神经元凋亡

　　作者：刘展， 黄慧伟， 黄彦， 彭聿平 作者单位：南通大学医学院生理学教研室， 南通 226001

　　【摘要】 目的：在抗凋亡成分Bcl-2、促凋亡成分Bax和凋亡关键酶半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl asparate-specific proteinase-3，caspase-3)的基因水平，探讨IL-6保护神经元防止N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)诱导的神经元凋亡。方法：取出生后8 d幼鼠的小脑进行颗粒神经元体外培养。在培养液中加入IL-6(40 ng/ml)，孵育 8 d后，用NMDA(100 μmol/L)刺激小脑颗粒神经元30 min，诱导神经元凋亡。用Real-time PCR法检测神经元内Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA表达水平。结果：未用IL-6预处理的神经元，在用NMDA刺激后，其表达Bcl-2 mRNA显著减少，表达Bax mRNA及caspase-3 mRNA明显增加。IL-6本身没有明显影响上述基因的表达。神经元用IL-6预孵育后，再用NMDA刺激，神经元内Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA表达水平与未用IL-6预处理的神经元比较，表现为Bcl-2上调、Bax和caspase-3下调的变化，这些变化均有显著意义。结论：NMDA可诱导神经元的凋亡，IL-6对NMDA诱导的神经元凋亡具有明显的抑制作用。

　　【关键词】 神经元凋亡;白介素-6;N-甲基-D-天门冬氨酸;Bcl-2;Bax;半胱氨酸蛋白酶-3;大鼠

　　Interleukin-6 prevents NMDA-induced apoptosis of the cultured cerebellar granule neurons

　　LIU Zhan， HUANG Huiwei， HUANG Yan，et al (Department of Physiology， School of Medicine， Nantong University， Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: We explored that IL-6 protected neurons against NMDA-induced apoptosis at the gene levels of anti-apoptotic Bcl-2， pro-apoptotic Bax and apoptotic enzyme cysteinyl asparate-specific proteinase-3 (caspase-3). Methods: The cerebellar granule neurons from postnatal 8-day infant rats were chronically exposed to IL-6 (40 ng/ml)， NMDA (100 μmol/L) was then added to the cultures and stimulated the neurons for 30 min to induce the neuronal apoptosis. Real-time PCR was employed to detect the expression of genes related to neuronal apoptosis， including Bcl-2， Bax and caspase-3. Results: NMDA stimulation of the cultured cerebellar granule neurons without IL-6 pretreatment led to a notable reduction of Bcl-2 mRNA expression， as well as a remarkable enhancement of Bax and caspase-3 mRNA expression. The NMDA stimulation of the neurons that had been pretreated with IL-6 caused a remarkable increase in Bcl-2 mRNA expression， as well as a marked decrease in Bax and caspase-3 mRNA expression in comparison with those of neurons lacking IL-6 pretreatment. Conclusions: NMDA can induce neuronal apoptosis. Chronic IL-6 exposure can protect neurons against NMDA-induced neuronal apoptosis.

　　[Key words] Neuronal apoptosis; Interleukin-6; N-methyl-D-aspartate; Bcl-2; Bax; Caspase-3; Rat

　　缺血缺氧等各种因素引起神经系统损伤时，神经末稍释放大量谷氨酸等兴奋性氨基酸，激活N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体，从而产生严重的神经毒性，引起神经元的损伤或死亡[1]。NMDA是谷氨酸受体亚型的激动剂，已有实验证实，NMDA能通过“兴奋性氨基酸毒性”诱导脑皮质细胞[2]和视网膜神经节细胞凋亡[3-5]。因此，抑制神经元凋亡可成为治疗某些神经系统疾病的关键。

　　近年来，细胞因子对神经系统的生长、发育和功能的影响已受到了广泛的关注。白介素-6(interleukin-6，IL-6)是一个多功能的细胞因子，在中枢神经系统的生理病理过程中扮演重要角色。在正常脑组织中IL-6的含量较低，但在某些病变的脑内IL-6的含量将会迅速而显著的增加[6-9]，说明IL-6与这些神经系统疾病有密切的关系且可能与修复神经元有关。然而，在这些神经系统病理状态下IL-6产生的意义尚不明确，仍有许多问题需要进一步的探讨。为此，我们利用NMDA诱导培养的小脑颗粒神经元(cerebellar granule neurons，CGNs)的细胞凋亡模型，在抗凋亡Bcl-2、促凋亡Bax和凋亡关键酶caspase-3的基因水平，观察IL-6的神经保护作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 CGNs的培养 取出生 8 d的Sprague-Dawley SD幼鼠2只，雌雄不拘。低温麻醉后取出小脑，用眼科剪把组织剪成1 mm3左右大小，胰酶消化后加入胰酶抑制剂和DNaseⅠ终止消化。最后细胞加入适量含有10%胎牛血清(杭州四季青公司)和25 mmol/L氯化钾的BME(Basal Eagles Medium，美国Sigma公司)，以2.83×105个/cm2的细胞密度接种于用多聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine，美国sigma公司)25 μg/ml包被的培养板中，然后置于5% CO2的 37℃培养箱(日本ESPEC公司)中培养 8 d。此外，接种后24 h在培养物中加入10 μmol/L Ara-C以抑制胶质细胞的生长，使神经元的纯度达95%以上。

　　1.2 IL-6慢性预处理CGNs 在CGNs培养的第1、4、7 d，加入IL-6(美国R&D公司)到培养物中，使IL-6的浓度在整个8 d的神经元培养期间始终保持在40 ng/ml。

　　1.3 NMDA急性损伤CGNs模型 上述培养8 d的CGNs，吸出培养液，用Locke缓冲液洗1遍，加入含NMDA(美国Sigma公司)100 μmol/L的Locke缓冲液，20 ℃作用30 min后吸弃，用 BME洗1遍，再加入原先吸出的培养液置于CO2培养箱中，5% CO2 37 ℃孵育6 h。

　　1.4 Real-time PCR法检测CGNs内Bcl-2、Bax及caspase-3 的mRNA 表达 取予不同处理的CGNs，提取RNA。逆转录生成第一链cDNA，再进行实时PCR扩增。引物由Invitrogen生物技术公司合成。序列如下：Bcl-2-sense：5’-GCAGAGATGTCCAGTCAG C-3’，Bcl-2-antisense：5’-CCCACCGAACTCAAAGAAGG-3’，预计扩增片段长度为129 bp;Bax-sense： 5’-ATGGGCTGGACACTGGACTTC-3’，Bax-antisense：5’- GAGCGAGGCGGTGAGGAC-3’，预计扩增片段长度为146 bp;caspase-3-sense：5’-GGAACGAACGGACCTGTG-3’，caspase-3- antisense：5’-GCCTCCACTGGTATCTTCTG-3’，预计扩增片段长度为188 bp;β-actin-sense：5’-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3’，β-actin-antisense：5’-TAGAGCCACCAA TCCACAC-3’，预计扩增片段长度为176 bp。设定PCR反应程序：95 ℃ 5 min 预变性，94 ℃ 20 s，62 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循环40次。

　　1.5 数据处理及统计学分析 Real-time PCR的结果以Ct值表示， 即PCR反应指数增长初期荧光信号跨越阈值时的反应循环数。相对定量采用比较Ct法， 根据等式Fold = 2-△△Ct来计算处理组和对照组之间目的基因的相对表达差异[10]，其中△Ct值代表同一样本中目的基因和管家基因的Ct值差异，而△△Ct值表示处理组和对照组间的△Ct值差异，计算结果以两组间目的基因拷贝数的比值，即Fold值来表示。本实验数据都用均数±标准差表示，采用SPSS 11.0统计软件中方差分析进行数据的处理和比较，以P<0.05表示差异具有统计学显著意义。

　　2 结 果

　　2.1 IL-6预防NMDA诱导的Bcl-2 mRNA表达抑制 CGNs用IL-6(40 ng/ml)预处理8 d后，用NMDA(100 μmol/L)刺激30 min，然后用Real-time PCR法检测神经元内Bcl-2 mRNA的表达水平。结果显示，未用IL-6预处理的神经元，在用NMDA刺激后，其表达Bcl-2 mRNA显著少于未用任何处理的对照组(图1);单独用IL-6预处理神经元后，未改变其中Bcl-2 mRNA的表达(图1);神经元用IL-6预处理，然后用NMDA刺激，其Bcl-2 mRNA的表达高于未用IL-6预处理的神经元(图1)，说明IL-6可预防NMDA诱导的神经元Bcl-2 mRNA表达抑制。

　　2.2 IL-6拮抗NMDA诱导的Bax mRNA表达增加 与未用任何处理的神经元相比，NMDA显著加强Bax mRNA的表达(图2)。单纯IL-6对神经元的Bax mRNA表达无抑制作用(图2)。神经元用IL-6预处理后再用NMDA刺激，其表达Bax mRNA水平显著低于未用IL-6预处理的NMDA刺激组(图2)。

　　2.3 IL-6抑制NMDA诱导的神经元内caspase-3 mRNA表达增加 结果如图3所示，与未用任何处理的神经元比较，NMDA显著加强caspase-3 mRNA的表达;IL-6单独处理对神经元的caspase-3 mRNA表达无明显抑制作用;NMDA刺激已用上述IL-6预处理的神经元后，神经元表达的caspase-3 mRNA水平明显低于未用IL-6预处理的神经元，已接近对照水平(图3)。

　　3 讨 论

　　正常情况下细胞凋亡是一种生理性调节机制，神经细胞凋亡被认为是维持神经系统生长发育动态平衡的必要手段，但在病理因素干扰下，如兴奋性氨基酸毒性导致细胞内钙水平升高，在众多基因的参与下，细胞凋亡异常，则会导致许多疾病的发生。体内外实验证明谷氨酸的兴奋性毒性主要是通过激活NMDA受体[11]，NMDA是特异性NMDA受体激动剂。有文献报道，谷氨酸通过上调Bax及下调Bcl-2蛋白的表达水平从而诱导小鼠海马神经元HT22细胞系发生凋亡[12]。在原代培养的皮层细胞中，谷氨酸经由线粒体信号转导的caspase活化通路上调caspase-3的表达水平诱导细胞凋亡[13]。我们实验室以前的研究表明，NMDA可导致培养的CGNs大量凋亡[14]。本实验中我们用NMDA(100 μmol/L)急性刺激(30 min)培养的CGNs，发现神经元内抗凋亡基因Bcl-2的表达下调，而促凋亡基因Bax及凋亡关键酶caspase-3 mRNA表达均显著增加，从而成功利用NMDA处理CGNs建立了神经元凋亡模型。

　　IL-6是具有基因多效性的细胞因子，在不同组织不同环境下，其作用也不尽相同。本实验观察到，经IL-6预处理的神经元与对照组相比，NMDA刺激后Bcl-2 mRNA表达明显增加，而Bax及caspase-3的表达则显著减少，上述结果表明IL-6可保护神经元，通过上调Bcl-2表达及下调Bax、caspase-3的表达，从而抵抗NMDA诱导的神经元凋亡。有文献报道，脑缺血时诱导产生的IL-6作为一个潜在的内源性神经保护因子拮抗NMDA受体介导的兴奋毒性作用，且在混合培养或单纯培养的大鼠皮层神经元中，IL-6呈剂量依赖性地保护神经元拮抗NMDA的毒性[15]。此外，rhIL-6能增加缺氧-复氧后海马培养神经元Bcl-2的表达和抑制Bax的表达，减少缺氧-复氧后海马神经元凋亡。我们的研究从抗凋亡、促凋亡和凋亡酶的各个层面，在基因水平进一步说明IL-6具有神经保护作用，因而为IL-6的临床研究和临床应用提供新的思路。

　　【参考文献】

　　[1] Monnerie H， Shashidhara S， Le Roux PD. Effect of excess extracellular glutamate on dendrite growth from cerebral cortical neurons at 3 days in vitro: Involvement of NMDA receptors[J]. J Neurosci Res， 2003，74(5): 688-700.

　　[2] Bonfoco E， Krainc D， Ankarcrona M ， Nicotera P. Apoptosis and necrosis: two distinct events induced， respectively， by mild and intense insults with N-methyl-D-aspartate or nitric oxide/superoxide in cortical cell cultures[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(16):7162-7166.

　　[3] Vorwerk CK， Kreutz MR， Dreyer EB， Sabel BA. Sytemic Lkynurenine administration partially protects against NMDA， but not kainite-induced degeneration of retinal ganglion cells， and reduces visual discrimination deficits in adult rats[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci， 1996，37(12): 2382-2392.

　　[4] Lam TT， Abler AS， Kwong JM， Tso MO. N- methyl-D-aspartate (NMDA)-induced apoptosis in rat retina. Invest Ophthalmol Vis Sci， 1999， 40(10): 2391-2397.

　　[5] Tezel G， Wax MB. Inhibition of capase activity in retinal cell apoptosis induced by various stimuli vitro[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci， 1999， 40(11): 2660-2667.

　　[6] Van Wagoner NJ， Benveniste EN. Interleukin-6 expression and regulation in astrocytes[J]. Neuroimmunol， 1999，100(1-2): 124-139.

　　[7] D’Arcangelo G， Tancredi V， Onofri F. Interleukin-6 inhibitions neurotransmitter release and the spread of excitation in the rat cerebral cortex[J]. Neurosci， 2000， 12(4): 1241-1252.

　　[8] Nelson TE， Ur CL， Groul DL. Chronic interleukin-6 expouse alters electrophysiological properties and calcium signaling in developing cerebellar Purkinje neurons in culture[J]. Neurophysiol， 2002， 88(1): 475-486.

　　[9] Qiu Z， Gruol DL. Interleukin-6，-amyloid peptide and NMDA interactions in rat cortical neurons. Neuroimmunol， 2003，139(1-2): 51-57.

　　[10] Livak KJ， Schmittgen TD. Analysis of relative gene Expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2﹣△△Ct method[J]. Methods， 2001，25(4): 402–408.

　　[11] Miller LP， Lyeth BG， Jenkins LW. Excitatory amino acid receptor subtype binding following traumatic brain injury[J]. Brain Res， 1990，526(1): 103-107.

　　[12] Zhang Y， Lu X， Bhavnani BR. Equine estrogens differentially in- hibit DNA fragmentation inducedby glutamate in neuronal cells by modulation of regulatory proteins involved in programmed cell death[J]. BMC Neurosci， 2003，4(10): 32-47.

　　[13] Zhang Y， Bhavnani BR. Glutamate-induced apoptosis in primary cortical neuron is inhibited by equine estrogens via down-regulation of caspase-3 and prevention of mitochondrial cytochrome c release[J]. BMC Neurosci， 2005， 6(2):13-17.

　　[14] Wang XC， Qiu YH， Peng YP. Interleukin-6 protects cerebellar granule neurons from NMDA-induced neurotoxicity[J]. Acta physiologica Sinica， 2007，59(2): 150-156.

　　[15] Ali C， Nicole O， Docagne F. Ischemia-induced interleukin-6 as a potential endogenous neuroprotective cytokine against NMDA receptor-mediated excitoxicity in the brain[J]. Cereb Blood Flow Metab， 2000，20(6): 956-966.