Edaravone体外诱导rBMSCs分化为神经元样细胞

　　作者：胡资兵，曾　荣，魏劲松，林　颢，吴少科，孙　欣，郑　鸿　 作者单位：(广东医学院附属医院骨科，广东 湛江　524001)

　　【摘要】 目的：探讨新型氧自由基清除剂依达拉奉诱导大鼠骨髓基质干细胞(rat bone marrow stromal cells， rBMSCs)分化为神经元样细胞的可行性。方法：采用密度梯度离心法和贴壁法分离纯化1月龄SD rBMSCs，体外培养扩增与传代，实验分依达拉奉处理组和空白对照组，每组各10例。处理组用终浓度0.02 g/L依达拉奉的无血清L-DMEM诱导6 h，对照组继续用10%胎牛血清、L-DMEM培养。观察细胞形态变化，免疫细胞化学鉴定神经元烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、巢蛋白、微管相关蛋白2的表达。结果：分化的rBMSCs胞体收缩，突起伸出;诱导后细胞神经元烯醇化酶阳性表达率(81.6±3.2)%，微管相关蛋白2阳性表达率(26.0±2.5)% ，胶质纤维酸性蛋白阳性表达率(5.6±1.9)%，巢蛋白阳性表达率(9.0±2.8)%。对照组均阴性表达。两组NSE、GFAP、Nestin比较差异均有统计学意义(P<0.001)，处理组NSE阳性表达明显高于MAP2、GFAP(P<0.005)。结论：依达拉奉可以诱导rBMSCs分化为神经元样细胞，从而为脊髓损伤的治疗提供种子细胞和理论基础。

　　【关键词】 骨髓基质干细胞; 神经分化; 神经元样细胞; 脊髓损伤

　　[ABSTRACT] Objective： To explore the feasibility of inducing differentiation of rat bone marrow-derived stromal cells(rat bone marrow stromal cells， rBMSCs)to neuron-like cells by edaravone. Methods： rBMSCs were separated and purified from one-month-old SD rat using density gradient centrifugation combining with attachment culture method， then cultured for passage and proliferation. The treatment group (10 samples) was treated with treated with edaravone at a final concentration of 0.02g / L in serum-free L-DMEM for 6 h; while the control group (10 samples) was cultured with 10 % fetal calf serum and L-DMEM. Morphologic changes were observed and expression of NSE， GFAP， MAP2 and nestin were analyzed by immunocytochemical method. Results： Body contraction and long procession were shown in differentiated stromal cells of the treatment group. The immunocytochemical detection showed that the percentage of NSE， MAP2， GFAP and nestin positive cells were (81.6±3.2)%， (26±2.5)%， (5.6±1.9)% and (9.0±2.8)%， in the treatment group， while in the control group they were all absent showing significant difference between the two groups (P<0.001). In the treatment group， expression level of NSE was significant higher than that of siMAP2， GFAP and Nestin (P<0.005). Conclusions： Edaravone shows in vitro promotion effects on the differentiation of rBMSCs into neuron-like cells， which provides theoretical foundations for its clinical application in spinal cord injury.

　　[KEY WORDS] Bone marrow stromal cells; Neuronal differentiation; Neuron-like cells; Spine cord injury

　　骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells， BMSCs)具有自我更新和多向分化的潜能，在特定条件下不仅可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞分化[1-4]，而且可以跨胚层向神经细胞分化[5]，具有扩增迅速、取材方便、可自体移植等特点，日益成为组织工程研究的热点。目前诱导BMSCs神经分化的主要试剂有抗氧化剂和细胞因子。本实验采用新型氧自由基清除剂依达拉奉体外定向诱导rBMSCs分化为神经元样细胞，旨在探讨依达拉奉诱导rBMSCs体外分化为神经细胞的可行性，为研究神经细胞的发育机制、治疗脊髓损伤等神经系统疾病提供实验基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　实验动物

　　取1月龄雄性SD大鼠15只，SPF级，屏障环境下饲养，洁净度超过10 000级，体质量120～150 g，购自广东医学院实验动物中心。

　　1.1.2　主要试剂和仪器

　　L-DMEM、胎牛血清和谷氨酰胺(Gibico公司)， Ficoll-Paque分离液(1.077×103 g/L， Pharmacia公司)，依达拉奉(edaravone，南京先声药业)，nestin、 NSE、GFAP、MAP2抗体、超敏SP试剂盒(福州，Maxim公司)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　rBMSCs的分离、培养和纯化

　　在无菌条件下分离SD鼠两侧股骨，分别剪开股骨两端，用注射器吸取5 mL培养液(DMEM、10% 胎牛血清(体积百分比)、2×10-3 mol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素)，冲出骨髓液，用4号针头反复吹打，轻轻叠加到密度为1.077×103 g/L的Ficoll-Paque分离液上，2 500 r/min离心30 min，收集单核细胞层，用DMEM重悬细胞，1 500 r/min离心4 min，弃上清，用含10%胎牛血清的L-DMEM重悬细胞，计数细胞制成细胞悬液，以1×106个/mL细胞密度种植于25 cm2的培养瓶，置于饱和湿度下、5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。原代第5天，首次换液，以后隔天换1次液 直到瓶底细胞接近融合，再行传代培养。传代培养时用0.25%胰酶和0.02%EDTA(体积比1∶1)消化，离心以1∶3的比例传代培养，隔天换液1次。

　　1.2.2　定向诱导rBMSCs向神经样细胞分化

　　实验分依达拉奉处理组和空白对照组，每组各10例。取第5代rBMSCs按1.0×105 cells/mL接种于6孔板内，细胞融合达60%左右时进行预诱导。处理组用1.0×10-5 g/L bFGF,20%胎牛血清，L-DMEM预诱导24 h，PBS洗涤2次，0.02 g/L依达拉奉无血清DMEM诱导6 h; 空白组用10%胎牛血清L-DMEM培养，不加任何预诱导剂和诱导剂。

　　1.2.3　免疫组化检测

　　采用SP法进行免疫细胞化学检测，不同组细胞经4%多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗，0.2%tritonX-100穿细胞膜30 min，过氧化物酶阻断液阻断内源性过氧化酶活性，非免疫动物血清封闭，分别加入兔抗鼠NSE抗体(1∶200)、兔抗鼠GFAP抗体(1∶200)、兔抗鼠nestin抗体(1∶200)，兔抗鼠MAP2抗体(1∶200),4 ℃孵育过夜，PBS洗涤，加入生物素标记的二抗，室温下孵育30 min，洗涤，加入链霉菌抗生物素一过氧化物酶溶液，孵育10 min，洗涤，DAB溶液孵育3 min，苏木素染核1 min， 细胞着棕黄色为阳性。 Olympus照相显微镜下随机数取10个非重叠视野(×100)，计算NSE、MAP2、GFAP和Nestin 阳性细胞数的比例。

　　1.3　统计学处理

　　采用SPSS 13.0软件统计分析，数据用均数±标准差(x-±s)表示，组间比较采用t-test，P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　rBMSCs形态学观察观察方法

　　倒置显微镜下观察，接种24 h骨髓中体积较大的单个核细胞贴壁。72 h细胞开始增殖。 15～20 d分散细胞集落间融合形成单层、排列有一定方向性的细胞集落。传代后迅速贴壁、伸展，细胞生长更加迅速，大部分变为梭形细胞。

　　2.2　rBMSCs 向神经元样细胞转化过程中的形态变化

　　预诱导24 h后，部分原来梭行的rBMSCs体积变小变圆，继续观察诱导1～24 h细胞形态变化。细胞质以细胞核为中心收缩，胞体成球形或锥形，细胞边缘变得不对称，逐渐长出突起，突起延伸交织成网，胞体透亮度增加，边缘可见透亮光圈。诱导1 h后细胞开始回缩，2 h后细胞成多角形，有些有较长突起形成，5 h后呈现典型神经元样细胞，6 h典型神经元样细胞不再增多，24 h细胞仍然可以贴壁生长;对照组细胞依然为对称的梭形，无突起形成(图1)。

　　注：a： 未经诱导P5代 细胞形态均一，呈梭形，旋涡状排列(×100);b： 预诱导24 h后，小部分细胞胞体变小变圆(×100);c：诱导6 h后，大部分细胞胞体缩小，突起延伸交织成网，胞体透亮度增加，边缘可见透亮光圈(×100)。图1　rBMSCs神经分化

　　2.3　免疫细胞化学分析

　　选诱导6 h的细胞和空白对照细胞做免疫细胞化学分析，结果显示：诱导6 h后，免疫细胞化学染色见神经元样细胞的胞体及部分突起棕黄色。分化的rBMSCs NSE强表达，MAP2阳性表达，GFAP、Nestin弱表达(图2,3)。处理组NSE阳性表达率(81.6±3.2)%，MAP2阳性表达率(26.0±2.5)%， GFAP阳性表达率(5.6±1.9)%，Nestin阳性表达率(9.0±2.8)%; 对照组中4种抗原均阴性表达。两组NSE、MAP2、GFAP、Nestin比较差异均有统计学意义(P<0.001)，处理组NSE与MAP2、GFAP比较差异有统计学意义(P<0.05)。

　　注：(棕黄色为阳性表达，苏木素核染为紫色)A： NSE染色呈强阳性(×400);B： GFAP染色弱阳性(×400);C： MAP2 染色阳性(×400); D： Nestin染色弱阳性(×400)。图2　依达拉奉处理组NSE， GFAP， MAP2 和 Nestin表达

　　A：NSE B：GFAP C：MAP2 D：Nestin NSE， MAP2，GFAP 和Nestin免疫组织化学染色均为阴性， GFAP(B)， MAP2(C) 和Nestin(D)的表达(×100)。图3　对照组NSE

　　3　讨论

　　中枢神经系统损伤后的修复与再生一直是神经科学研究的热点。近年研究表明， BMSCs具有向神经细胞分化的能力，将其作为治疗神经系统疾病的移植种子细胞具有极大的优越性、可行性和必要性。

　　BMSCs 在骨髓中的含量并不高， 因此，如何选用最佳的方法将体内的BMSCs 在离体条件下进行分离、纯化并大量扩增，为移植准备充足的种子细胞就显得尤为重要。目前，国内、外分离BMSCs 的方法有密度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细胞仪分选法及磁珠分离法[6-8]。由于BMSCs 没有特异性表面标志， 所以流式细胞仪分选法和磁珠分离法的效果并不理想[9]。本实验采用密度梯度离心法及贴壁筛选法相结合，使获得的rBMSCs 纯度大大提高，为后续神经元的诱导分化提供良好的细胞准备。目前，有关BMSCs 向神经元的诱导分化，主要采用多种细胞因子、基因转染以及化学诱导剂诱导的方法[10-12]。但是，前两者诱导时间长，获得神经元样细胞的百分率较低。

　　依达拉奉是一种脑保护剂，是一种强效的羟自由基清除剂及抗氧化剂，主要成分为3-甲基-1-苯基2-吡唑啉-5-(3-Methy-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)，可抑制脂质过氧化反应，减轻脑内花生四烯酸所致脑水肿;可防止由花生四烯酸的代谢中间体脂质过氧化物所致氧化性细胞损害，减少缺血半暗带的面积，抑制迟发性神经元死亡;可防止血管内皮细胞损伤，发挥抗缺血作用[13]。

　　本实验采用密度梯度离心法联合贴壁筛选法分离和纯化rBMSCs。结果发现，培养15～20 d后细胞形态均一，排列规则，传代细胞贴壁迅速、生长良好。处理组经低浓度的bFGF(1.0×10-5 g/L)预诱导24 h，目的是快速增殖rBMSCs，为进一步细胞诱导提供准备。本实验室用终浓度0.02 g/L依达拉奉诱导rBMSCs[14]，1 h后细胞开始回缩、透亮，2 h后细胞有较长突起形成，5 h后呈现典型神经元样细胞，24 h细胞仍然可以贴壁生长。进一步的免疫细胞化学染色结果显示，分化的细胞表达强表达神经元特异性标记物NSE、MAP2，，弱表达神经胶质细胞标记物GFAP 和神经干细胞特异性标记物nestin。与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001)。NSE与MAP2、GFAP表达比较亦有显著性差异(P<0.05)。以上结果表明，依达拉奉具有诱导rBMSCs分化为神经元样细胞的能力，诱导后的细胞具有神经元的表型。

　　目前，依达拉奉实验研究主要观察脊髓损伤和脑梗死动物模型疗效，效果令人满意。主要观点是依达拉奉能迅速清除氧自由基，抑制脂质过氧化，保护神经元，保护脊髓免受继发性损伤[15]。基于以上研究基础，单独使用依达拉奉成功诱导了rBMSCs向神经元方向转化，不仅分化时间快，细胞的生长活性良好，而且分化率高。从而为依达拉奉治疗脊髓损伤的机制的阐明提供了新的方向。

　　总之，利用依达拉奉体外成功地诱导rBMSCs向神经元样细胞分化，从而为今后BMSCs 移植治疗脊髓损伤、老年痴呆症、脑梗死等神经系统疾病提供理论依据。但是，定向分化出的神经元在体内是否可以长期存活并定向发挥正常神经细胞的功能、神经分化的具体信号调控机制等问题，尚有待进一步研究。

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