慢病毒在大鼠胶质瘤细胞基因转导中的应用

　　作者：林健,戴学军,王伟民,袁振华　　作者单位：1. 中国人民解放军广州军区广州总医院神经外科， 广东 广州 510010; 2. 北京本元正阳基因技术有限公司， 北京 100176

　　【摘要】目的应用慢病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV-TK) 基因转导大鼠9L胶质瘤细胞。 方法 构建慢病毒表达质粒pLenti6/V5-TK并以PCR、酶切及测序等方法鉴定。利用ViraPowerTM慢病毒表达系统，将重组质粒与包装混合物 (Packaging Mix) 共同转染293T细胞生产假病毒颗粒，转染48 h后收集培养上清，用其感染大鼠9L胶质瘤细胞，以抗稻瘟菌素(BSD) 筛选出9L-TK细胞。RT-PCR、Western blot方法检测TK基因在9L-TK细胞中的表达。用MTT方法测试更昔洛韦 (GCV) 对体外培养的9L-TK细胞杀伤效果。 结果 构建的重组质粒pLenti6/V5-TK经PCR、酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达2.7 × 105转导单位 (TU)/ml。经BDS筛选获得的9L-TK细胞RT-PCR及Western blot结果显示TK基因表达阳性，且GCV对该细胞作用敏感。 结论 成功利用慢病毒实现了TK基因转导大鼠9L胶质瘤细胞。

　　【关键词】 慢病毒载体; 质粒; 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因; 大鼠; 神经胶质瘤; 9L细胞

　　Application of lentivirus in gene transduction of rat Glioma cells

　　LIN Jian, DAI Xuejun, WANG Weimin, et al

　　Department of Neurosurgery, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010, China

　　Abstract: Objective To transfer herpes simplex viral thymidine kinase gene into rat glioma 9L cells using lentivirus. Methods The lentivirus-expressing plasmid pLenti6/V5-TK was constructed and identified by PCR, restriction enzymes and DNA sequence analysis. The identified pLenti6/V5-TK plasmid and the ViraPowerTM Packaging Mix were cotransfected into 293T cells to produce a replication- incompetent lentivirus. The cultured supernatant was collected 48 h later, and the lentivirus was added into rat glioma 9L cells and selected with Blasticidin (BSD) for the stably transduce 9L-TK cells. The expression of TK gene in 9L-TK cells was detected by RT-PCR and Western blotting. The killing activities of ganciclovir (GCV) for 9L-TK cells were assayed by MTT. Results The TK gene sequence of pLenti6/V5-TK plasmid was consistent with Gen Bank V00470 by PCR, enzyme digestion and sequencing. The electrophoresis results of constructed plasmid by means of PCR and restriction enzymes were coincident with expectation. The titer of cotransfected lentivirus was 2.7×105 transducing units (TU)/ml. RT-PCR and Western blot results showed that the TK gene and TK protein were positively expressed in 9L-TK cells. The 9L-TK cells were sensitive to GCV. Conclusion The lentivirus-mediated gene transfer system can successfully transfer TK gene into rat glioma 9L cells.

　　Key words: lentiviral vectors; plasmids; herpes simplex viral thymidine kinase gene; rats; glioma; 9L cell 单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV-TK)/更昔洛韦 (GCV) 系统用于恶性脑胶质瘤基因治疗的临床效果不满意，其中基因传递载体系统效率不高是主要原因之一[1，2]。慢病毒载体是由Ⅰ型人免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus，HIV) 改造的新型病毒载体，具有转染率高、可感染分裂期和非分裂期哺乳动物细胞及目的基因可长期稳定表达等特点[3-5]。本研究构建表达TK基因的慢病毒载体质粒，利用ViraPowerTM Lentiviral Expression Systems 包装生产复制缺陷并携带TK基因的慢病毒，该病毒感染大鼠9L胶质瘤细胞，成功获得TK基因的高效、稳定表达。

　　1 材料与方法

　　1.1 细菌、质粒与细胞 大肠杆菌DH-5α感受态细胞 (Tiangen)。质粒pSNAV2.0-TK、pLenti6/V5-EGFP (北京本元正阳基因技术有限公司)。293T细胞来源于ATCC (北京本元正阳基因技术有限公司);野生型大鼠9L胶质瘤细胞 (美国洛杉矶加州大学神经外科Linda M，Liau博士惠赠)。

　　1.2 主要试剂 ViraPowerTM Packaging Mix、Trizol (Invitrogen公司)、LipofactemineTM 2000、Blasticidin，各种限制性内切酶、DNA Taq酶、T4DNA连接酶 (TaKaRa)，反转录试剂盒 (Promega)，凝胶回收试剂盒 (U-gene)，质粒提取试剂盒 (Tiangen)，GCV (Invivogen)，RIPA细胞裂解液 (上海申能博彩)，小鼠抗TK单抗[3B3.E11] (Novus)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG (Invitrogen)，四甲基偶氮唑蓝 (MTT) (Sigma)，DMEM、胎牛血清 (fetal bovine serum，FBS) (Gibco)。

　　1.3 引物合成 参照Gene Bank中HSV-TK的cDNA序列，设计TK基因的PCR引物。TK基因：5'端引物： 5'-GCCAGAATTCATGGCTTCGATCCCCGGC-3';3'端引物： 5'-CTGCGAATTCTCAGTTAGCCTCCCCC AT-3';甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)：5'端引物 ：5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3';3'端引物： 5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。其中扩增的TK基因长度为1 131 bp。大鼠基因为RT-PCR内参，长度为252 bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

　　1.4 慢病毒载体质粒 pLenti6/V5-TK构建及鉴定的具体方法参照文献[6]，EcoRⅠ+ SalⅠ双酶切质粒pSNAV2.0-TK获得TK基因片段约为1.2 kb，EcoRⅠ+ SalⅠ双酶切质粒pLenti6/V5-EGFP获得线性化的pLenti6/V5载体片段约为7.0 kb，TK基因片段与载体片段以黏端结合方式连接 (其中SalⅠ与XhoⅠ为同尾酶) 构建重组质粒pLenti6/V5-TK。重组质粒分别用SamⅠ单酶切、EcoRⅠ+ XhoⅠ双酶切鉴定，并应用Vector NTI Advance 10 软件对质粒的酶位点及酶切片段进行预测分析。以重组质粒为模板，用TK基因引物行PCR鉴定，反应条件：预变性 94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min、56 ℃ 1 min、72 ℃ 80 s循环30次，延伸 72 ℃ 5 min，4 ℃保持。重组质粒DNA测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

　　1.5 表达TK基因的慢病毒包装生产 本试验利用ViraPowerTM Lentiviral Expression Systems建立TK基因表达的慢病毒包装系统。采用脂质体介导的质粒转染方法，将质粒pLenti6/V5-TK与已优化比例混合的包装混合物ViraPowerTM Packaging Mix (包装质粒pLP1、rev质粒pLP2和包膜蛋白质粒pLP/VSVG) 4质粒共转染293T细胞，转染后48 h收集细胞培养上清，3 000 rpm 离心10 min后分装，-70 ℃低温保存或直接用于感染细胞及病毒滴度测定。病毒滴度测定按ViraPowerTM Lentiviral Expression Systems说明书进行。

　　1.6 慢病毒感染大鼠9L胶质瘤细胞的方法 9L胶质瘤细胞培养参见文献[7]，6孔板中对数生长期9L胶质瘤细胞融合达90%，加入按1:1混合的含慢病毒液DMEM完全培养液1 ml，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养6~8 h，再每孔补加DMEM完全培养液1 ml 继续培养过夜，次日更换DMEM完全培养液培养24 h，第3天更换为含6 μg/ml BSD 的DMEM完全培养液筛选培养7～10 d，每3～4 d换液，获得的抗BSD细胞扩增、传代。相同条件下，携带增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 的慢病毒液感染9L胶质瘤细胞为参照。

　　1.7 RT-PCR检测TK基因的表达 取9L-TK细胞和9L胶质瘤细胞各5×106，Trizol试剂提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，再以TK基因引物行PCR扩增，反应条件同前。同时以GAPDH作内参，PCR反应条件为：预变性 94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s循环30次，延伸 72 ℃ 5 min，4 ℃保持。

　　1.8 Western blot检测TK蛋白的表达 取9L-TK细胞和9L胶质瘤细胞各5×106，用RIPA裂解液裂解细胞，12 000 rpm离心15 min后取上清，SDS-PAGE分离后半干法转至硝酸纤维素滤膜，5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，加入小鼠抗TK单抗 (一抗)，37 ℃孵育过夜，再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG (二抗) 孵育1 h，ECL法显色后摄影。以GAPDH为内参。

　　1.9 GCV对9L-TK细胞增殖抑制作用的检测 采用MTT 方法检测GCV对体外培养的9L-TK细胞增殖抑制效果，野生型9L细胞为对照。以1 × 104 个/孔铺96孔板，GCV浓度分别为 0、10、30、50、70、100、200、500 μg/ml，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养4 × 24 h。倒除培养基，加入含MTT (终浓度为0.5 mg/ml) 的无血清DMEM培养基 37 ℃温育4 h。再倒除培养基，加入二甲基亚砜 (DMSO) 显色。在酶标仪上波长570nm测定光密度OD值。

　　1.10 统计学分析 MTT采用完全随机设计，实验重复3次，所获计量资料 (OD值) 利用SAS软件进行统计分析，数据比较采用两因素析因设计定量资料的方差分析，以P <0.05 为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 质粒构建及鉴定 重组质粒pLenti6/V5-TK图谱。以SamⅠ单酶切、EcoRⅠ+ XhoⅠ双酶切重组质粒结果与预期吻合，其因SalⅠ与XhoⅠ为同尾酶，黏端结合后的“焊接点”既非XhoⅠ，亦非SalⅠ，故用EcoRⅠ+ XhoⅠ双酶切不能将TK基因片段切下。重组质粒PCR显示TK基因表达 。质粒测序结果与Gene Bank比对，TK基因序列与Gene Bank中V00470一致。

　　2.2 TK慢病毒的生产及滴度测定 pLenti6/V5-TK质粒与包装混合物ViraPowerTM Packaging Mix 4质粒共转染293T细胞，转染48 h后收集细胞培养上清，以10的倍数稀释浓度感染6孔板培养的9L胶质瘤细胞，10 μg/ml BSD筛选10 d后，结晶紫染色细胞，计数阳性细胞克隆数确定病毒滴度，该慢病毒滴度为2.7 × 105转导单位 (transducing units，TU)/ml。

　　2.3 慢病毒感染9L胶质瘤细胞 携带TK基因的慢病毒感染9L胶质瘤细胞，经终浓度6 μg/ml BSD筛选获得9L-TK细胞，共传4代，各代细胞形态及倍增时间均一，与亲本野生型9L胶质瘤细胞相似。相同条件下携带EGFP的慢病毒感染获得的9L-EGFP细胞，传代后EGFP蛋白表达稳定。

　　2.4 TK基因的表达 Trizol抽提9L-TK细胞总RNA，RT-PCR显示TK基因表达阳性。Western blot 结果显示9L-TK细胞中TK蛋白表达阳性。

　　2.5 GCV对9L-TK细胞杀伤测试 在GCV浓度≥10 μg/ml条件下培养96 h，9L-TK细胞大量死亡、崩解，几乎未见存活细胞，生长完全受抑制 ;而野生型9L胶质瘤细胞在GCV浓度<200 μg/ml时，细胞增殖被抑制不明显，但GCV浓度≥200 μg/ml时亦有较明显的细胞死亡，显示高浓度GCV对9L胶质瘤细胞同样存在毒性。MTT所获OD值采用两因素析因方差分析显示细胞分组及GCV浓度两因素的交互作用项具有统计学意义，在此方差分析基础上进行两两比较，将GCV浓度分别控制在不同水平上，在细胞分组间进行两两比较。MTT检测结果显示GCV为低浓度 (10 μg/ml) 时，9L与9L-TK细胞比较有显著性差异 (t = -11.637, P<0.0 001);GCV为500μg/ml高浓度时，9L与9L-TK细胞比较无显著性差异 (t = -0.587，P>0.05)。

　　3 讨 论

　　单纯疱疹病毒胸苷激酶与更昔洛韦组成的HSV-TK-GCV系统，是目前研究和应用最多的肿瘤自杀基因治疗方案，已广泛应用于各类肿瘤，包括恶性脑胶质瘤的临床基因治疗，但效果并不满意。多数学者认为，作为TK基因转导常用的逆转录病毒、腺病毒等病毒载体系统存在不足是临床效果差的重要原因之一[1，2]。

　　理想的病毒载体应该能同时提供高效的基因转移、长期稳定的基因表达及良好的生物安全性。慢病毒载体是以Ⅰ型HIV为基础改造和构建的新型载体，具有可高效感染分裂及非分裂细胞 (优于逆转录病毒)、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达及免疫反应小 (优于腺病毒) 等特点，是目前较理想的基因转移载体[3-5]。本研究构建重组质粒pLenti6/V5-TK所使用的载体属第三代慢病毒载体，ViraPowerTM Lentiviral Expression Systems为携带外源基因的慢病毒载体质粒、包装质粒pLP1、rev质粒pLP2和包膜蛋白质粒pLP-VSVG 4质粒共转染293T细胞生产假病毒颗粒 (http://www.invitrogen.com)[8，9]。该包装系统提高了生物安全性：①载体质粒去掉了HIV大部分的蛋白编码基因，不存在产生复制型HIV的可能性;②包装质粒中缺失LTRs，因而载体基因组只能在生产细胞中表达，而不可能被整合入病毒粒子;③假型慢病毒载体无复制性，只携带外源基因，相当均一，完全去除了野生型病毒;④载体基因组有自灭活机制(SIN)，整合于宿主基因组后，不可能再被拯救而产生可被包装的病毒基因组。因而其生物安全性较高，安全性考虑主要来自其整合特性，即慢病毒载体基因仍然是随机整合到细胞染色体DNA中，而非定点整合。

　　本研究构建的pLenti6-V5-TK质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确，利用ViraPowerTM慢病毒表达系统包装生产携带TK和EGFP基因的慢病毒分别感染大鼠9L胶质瘤细胞，获得9L-TK和9L-EGFP细胞经多次扩增传代，经检测外源基因均成功稳定表达。我们获得未经纯化的慢病毒滴度即达2.7×105 TU/ml，文献报道通过低温超速离心纯化浓缩技术，可将慢病毒滴度提高至109～1 010级TU/ml[10，11]。目前新型慢病毒载体在胶质瘤基因治疗中应用鲜有报告，我们成功构建的SHV-TK基因载体及建立的慢病毒表达系统将应用于后续的脑胶质瘤基因治疗研究。

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