甘珀酸对戊四氮点燃癫痫大鼠行为和深部脑电活动的影响

　　作者：兰莉，赵新，兰怡，段丽，曹荣，刘煜，饶志仁 作者单位：1. 第四军医大学唐都医院儿科;2. 第四军医大学唐都医院神经内科，陕西西安 710038;3. 第四军医大学神经科学研究所，陕西西安 710032;4. 武警陕西总队医院理疗科，陕西西安 710054

　　【摘要】 目的 通过观察缝隙连接(GJ)阻断剂甘珀酸(CBX)对戊四氮(PTZ)点燃癫痫大鼠行为和深部脑电活动的影响，探讨GJ在癫痫发展中的作用。方法 ①健康成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠15只，其中10只每日腹腔注射PTZ[35mg/(kg·d)]至点燃后，再分别腹腔注射CBX(10mg/kg)(KCBX组)和生理盐水(K组)3d;作为对照的5只大鼠(NS组)始终每日腹腔注射生理盐水。观察3组大鼠惊厥行为的变化。②另选7只SD大鼠，于海马、杏仁核埋置电极后点燃，行NS、CBX干预，观察深部脑电活动改变。结果 ①PTZ点燃癫痫大鼠出现自发性抽搐，自发性抽搐次数K组>KCBX组>NS组。②点燃癫痫大鼠脑电表现多种形式的癫痫样波，以阵发性多棘、多棘慢波为特点;CBX干预后，阵发性节律性棘慢波减少，背景节律波幅增高，慢波增多。结论 GJ参与癫痫的发生和发展，其阻断剂CBX有潜在的抗惊厥作用。

　　【关键词】 癫痫;点燃;神经元;星形胶质细胞;缝隙连接;甘珀酸

　　基金项目：军队“十五”重点课题(No.01Z082)

　　Effect of carbenoxolone on behavior and electroencephalogram　of PTZkindled epileptic rats

　　Lan Li, Zhao Xin, Lan Yi, Duan Li, Cao Rong, Liu Yu, Rao Zhiren

　　1. Department of Pediatrics, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University;

　　2. Department of Neurology, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Xian 710038;

　　3. Institute of Neurosciences, the Fourth Military Medical Unversity, Xian 710032;

　　4. Department of Physiotherapy and Rehabilitation, Shaanxi Provincial Corps Hospital ofChinese Peoples Armed Police Force, Xian 710054, China

　　ABSTRACT: Objective To explore the effect of carbenoxolone, a gap junction blocker, on seizure and electroencephalogram (EEG) of PTZkindled epileptic rats. Methods ① Of the 15 adult male SpragueDawley rats used in the study, 10 were intraperitoneally injected with PTZ [35mg/(kg·d)] to established epilepsy model of kindled rats, and then were intraperitoneally injected with carbenoxolone (CBX, 10mg/kg) or normal saline (NS). The other 5 rats were in control group. The changes of seizures were analyzed within K group, KCBX group and NS group. ② After putting electrode in the hippocampi and amydaloid nucleus, epilepsy model of kindled rats was established in 7 rats. The changes of brain wave induced by injection of CBX in the PTZkindled epileptic rats were analyzed. Results ① Spontaneous seizures appeared in PTZkindled epileptic rats. The number of accumulative times of seizures in KCBX group rats was fewer than that in K group rats. ② EEG recordings of the PTZkindled epileptic rats displayed various seizure waveforms. The rhythmic spikes or the spike and wave complexes were obvious properties of the PTZkindled epileptic rats. After treated with CBX, the rhythmic spike and wave complexes decreased; meanwhile, the amplitude of background rhythm enlarged and slow waves increased. Conclusion Gap junction and hemichannels are closely involved in epileptogenesis. Gap junction blocker may have an antiepileptic potential.

　　KEY WORDS: epilepsy; kindle; neuron; astrocyte; gap junction; carbenoxolone

　　癫痫是一种常见的神经系统疾病，以脑神经元发作性异常放电导致临床反复发作为特征的脑功能障碍综合征，大脑局部神经元群异常的同步化去极化，是产生癫痫的基础。临床发作及过度放电是诊断癫痫的2个必备条件，同时作为判断药物疗效的指标。

　　目前约有三分之一的癫痫患者采用现有治疗手段难以奏效，亟待寻找新的药物或方法。甘珀酸(carbenoxolone, CBX)又名生胃酮，最初用于治疗消化道溃疡病，具有较好的血脑屏障通透性[1]，后来发现其是一种缝隙连接(gap junction, GJ)阻断剂。在本研究中，我们通过观察CBX对戊四氮(pentylenetetrazole, PTZ)点燃癫痫大鼠惊厥行为和大鼠深部脑电的影响，探讨GJ阻断剂的抗癫痫作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 模型制作和行为学分组

　　健康成年雄性SpragueDawley(SD)大鼠15只，由第四军医大学实验动物研究中心提供，体重170-200g，于温暖安静环境中饲养。大鼠随机分为3组：①PTZ点燃组(kindled，K组，n=5)，动物腹腔注射(i.p.) PTZ [35mg/(kg·d)]至点燃后改用生理盐水(physiological saline, NS) i.p.3d;②点燃后阻断组(KCBX组，n=5)，先行PTZ注射，完全点燃后改用i.p. CBX [10mg/(kg·d)]，连续3d;③NS对照组(NS组，n=5)，i.p.等量NS。取相同时间点处死。

　　1.2 行为学观察

　　每日观察大鼠ip后行为，参考Racine标准，评定癫痫发作级别。凡连续出现3次Ⅳ级以上发作，为完全点燃。

　　动物癫痫发作分级标准：0级：无反应;Ⅰ级，面部抽搐、点头、奔跑;Ⅱ级：阵挛;Ⅲ级：肌阵挛，有后退动作;Ⅳ级：全身阵挛、肌阵挛发作，伴直立位，或摔倒;Ⅴ级：全身强直阵挛发作，失去体位控制。凡连续出现3次Ⅳ级以上发作，为完全点燃。点燃后，每日观察1h，记录自发性抽搐的次数。

　　1.3 脑电记录

　　健康成年雄性SD大鼠7只，重量200-220g(第四军医大学实验动物中心提供)，温暖安静环境中饲养48h后，行电极埋置术。苯巴比妥钠(50mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，大鼠头部固定于Narishige立体定向仪(Japan)上，行手术安放电极(参照Paxinos and Watson大鼠解剖定位图谱)。每只大鼠选择4个位置：分别为双侧杏仁核、海马。术后悉心饲养。

　　电极埋置后7d，记录基础脑电活动，以后i.p. PTZ [Sigma, 35mg/(kg·d)]直至点燃，存活3d。点燃后大鼠行脑电监测，隔日1次，连续6次。每只大鼠预先i.p. PTZ 25mg/kg，出现IV-V发作，再麻醉，记录睡眠脑电图(electroencephalogram, EEG)1.5h，每3min为一时间段，计算各时间段内癫痫样发放累计秒数。其中前15min记录PTZ注射后脑电表现，于第6个3min再i.p. NS或CBX，每只大鼠均有3次NS干预和3次CBX干预的脑电记录，分析NS、CBX干预后脑电变化。EEG记录使用南京伟思公司视频脑电描记系统。采用重复测量方差分析统计方法。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠行为学观察

　　NS组大鼠安静、温顺;点燃后K组大鼠出现自发性点头、面部抽搐、阵挛、肌阵挛Ⅲ级和Ⅲ级以下发作，易激惹，相互厮打;KCBX组大鼠也有自发性点头，面部抽搐，阵挛少见，未见肌阵挛，即Ⅲ级以下发作，喜卧，活动减少。自发性抽搐次数K组>KCBX组>NS组(图1)。

　　2.2 大鼠脑电图改变

　　实验大鼠的基础脑电波以8-12Hz为主，波幅50-100μV(图2A)。PTZ点燃癫痫大鼠EEG表现多种形式的癫痫样波，有高波幅多棘波、多棘慢波、阵发性棘波等。以持续0.1-0.3s、5-8Hz的发作性节律棘慢波为特点(图2B)，阵发性多棘波、多棘慢波发放也常见到，波幅多在100μV以上，可高达500μV。NS干预，未扰乱PTZ诱发的发作性棘慢波节律(图3A);CBX注射后，背景节律波幅增高，阵发性节律棘慢波减少，慢波有所增多(图3B)，癫痫样发放累计每3min秒数下降(图4)，下降幅度大于NS干预的大鼠(图5)。应用重复测量方差分析，两组之间有统计学差异(F=5.113, P=0.043)。

　　3 讨 论

　　GJ是由缝隙连接蛋白(Cx)构成的膜通道，允许小的带电离子、小分子物质(分子质量<1200u)、第二信使(如Ca2+、cAMP)通过，实现细胞间电学联系和物质交换，进行细胞间通讯。中枢神经系统存在丰富的缝隙连接。GJ通道的阻抗小，是细胞间电偶联的有效形式，易于在偶联的细胞间形成同步化放电[2]。

　　GJ参与癫痫的发生发展。有报道4AP诱导癫痫模型的原发点和镜像点Cx43、Cx36、Cx26表达上调[3];癫痫患者病灶部位的Cx43、Cx32有显著增高[4]。在海马脑片实验中发现：自发的快速振荡依赖于GJ，而非化学性突触传递;轴突GJ构成的神经网络，在没有化学性突触传递时可以产生快速振荡[56]。动物实验和人类癫痫患者的惊厥活动是以高频电振荡激发而出现[7]。Traub[1]记录了难治性癫痫儿童硬膜下EEG，发现快速振荡活动发生在惊厥发作之前，而且在惊厥爆发和阵发性发作时加强，认为快速振荡可以诱发惊厥发作;另一方面，GJ可能引起2次爆发[1,6]。目前观察最多的是抑制性神经元之间的电突触和同步化作用。如Cx36是神经元特有的GJ蛋白，分布在皮质2-6皮层、海马的GABA能中间神经元，形成密切联系的电网络;海马和新皮质的脑片实验均有报道中间神经元产生振荡，被认为是对靶神经元的一个周期性抑制，导致了较多神经元的同步性振荡活动[810]。

　　CBX是从甘草中分离出的甘草酸衍生物，是广谱的GJ阻断剂，与GJ结合，使之构象发生改变，可减少电偶联，导致通道关闭，具有很强的阻滞作用，而不影响神经元的固有特性[6,8]。CBX作为非选择性GJ阻断剂，对中间神经元网络也是一种抑制。GJ阻滞剂可消除或大幅度减少培养神经元和海马脑片的自发振荡，并且祛除振荡引起的不同形式的癫痫样波发放[1,6]。离体实验发现100μmol/L CBX抑制由GJ通道开放剂TMA刺激诱发的癫痫样放电[1]。Gajda等将4氨基吡啶(致痫剂)和生胃酮直接处理在麻醉大鼠的大脑皮层表面，记录脑电，发现生胃酮延长痫样放电潜伏期，减轻痫样放电程度[3]。

　　点燃被公认为是一种理想的癫痫动物模型，它与人类癫痫发生与形成具有高度相似性，具有自发性和急性诱发癫痫发作的优点。本实验，点燃大鼠出现自发性抽搐，CBX应用后，自发性抽搐减少，从行为学方面显示CBX可能潜在的抗惊厥作用。我们采用立体定位植入电极在大鼠脑深部的海马、杏仁核，记录到PTZ点燃后大鼠癫痫波的发放，以阵发性棘慢波为主，CBX干预后，脑电活动的节律性癫痫样发放被打乱，减少。Gareri报道DBA/2癫痫小鼠联合应用传统抗癫痫药和CBX，从对抗痫药剂量影响说明CBX能加强部分抗癫痫药物的效果[11]。本实验结果与Gareri结论吻合，并更具脑电活动方面的支持。

　　本研究采用PTZ慢性点燃癫痫模型符合人类癫痫的病理生理机制，成功记录到点燃大鼠行为学改变和脑电痫波的发放，以及同一大鼠CBX干预自发抽搐行为和脑电痫样发放减少的变化。于整体动物角度提示GJ参与癫痫发作和CBX潜在的抗惊厥作用，为抗癫痫药物的研发提供新的方向。

　　致谢：感谢黄远桂教授、尚磊博士、王峰、卞波宁医师的指正和帮助。

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