永生化人骨髓基质细胞的表面抗原及多向分化研究

　　作者：桂松柏　张亚卓　孙梅珍　王红云　李丹　　作者单位：首都医科大学， 北京 100054; 北京市神经外科研究所， 北京 100050

　　【摘要】 目的 研究本所转入人端粒酶逆转录酶基因的人骨髓基质细胞 (hMSC-TERT细胞) 的生物学特性。 方法 复苏hMSC-TERT细胞第30代，扩增，流式细胞仪检测细胞表面抗原;进行体外脂肪细胞 、成骨细胞定向诱导，并分别进行油红O染色、碱性磷酸酶染色及von Kossa染色。 结果 hMSC-TERT细胞表面抗原检测CD34、CD45、CD44、CD106、CD166均为阴性;脂肪细胞定向诱导后油红O染色见胞浆内有红色脂肪颗粒，成骨细胞定向诱导后见胞浆内有碱性磷酸酶染色阳性黑褐色颗粒，von Kossa染色见有钙结节形成。 结论 hMSC-TERT细胞依然保留骨髓基质干细胞的自我更新特性及多向分化潜能。

　　【关键词】 人骨髓基质细胞 端粒　末端转移酶 抗原　分化　细胞分化

　　Biological characteristics of human bone marrow stroma cells immortalized by human telomerase reverse transcriptase gene

　　GUI Songbai, ZHANG Yazhuo, SUN Meizhen, et al

　　Capital Medical University, Beijing 100054, China; Beijing Neurosurgical Institute, Beijing 100050, China

　　Abstract: Objective To investigate the biological characteristics of human bone marrow stroma cells immortalized by human telomerase reverses (hMSC-TERT). Methods The 30th passage hMSCs-TERT were amplified after recovery of cryopreservation. The surface antigenic features of the cells were analyzed by flow cytometry. Differentiation induction of adipose cells and osteoblasts was performed in vitro. The induced hMSCs-TERT were examined by Oil red-O staining, alkaline phosphates staining and von Kossa staining. Results The hMSC-TERT was negative for CD34, CD45, CD44, CD106 and CD166. After the induction, accumulated cytoplasmatic red lipid droplets were clearly visible in the adipose cells by Oil red O staining, and alkaline phosphates-positive pitchy grains formed in the intracytoplasm and calcium nodes were found by von Kossa staining in the osteoblasts. Conclusion The hMSC-TERT still retains the self-renewing characteristics of bone marrow stromal stem cells and pluripotent differentiation potential.

　　Key words: human bone marrow stroma cell; telomerase; antigens, differentiation; cell differentiation

　　2003年北京市神经外科研究所，将人端粒酶逆转录酶基因 (hTERT) 转入人骨髓基质细胞 (hMSC) 获得了永生化骨髓基质细胞 (hMSC-TERT)，该细胞系体外传代82 PDs (群体位增次数，population doublings) 仍保持增殖活力，较普通hMSC增殖迅速;外源hTERT基因稳定表达并保持正常染色体核型，体外诱导可以向神经元样细胞分化[1]。本研究对本所hMSC-TERT进一步进行细胞表面抗原测定及脂肪细胞、成骨细胞分化诱导，以期证实该细胞依然保留hMSC多向分化潜能的特征，为深入研究该细胞的神经组织修复能力提供实验基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂与仪器 α-MEM、胎牛血清 (FCS) (Gibco公司)，β-磷酸甘油钠、抗坏血酸磷酸盐、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (IBMX)、吲哚美辛、牛胰岛素、地塞米松、油红O染料 (Sigma公司)，硫化胺 (上海振兴化工二厂)，氯仿、硝酸钴 (北京化学试剂公司)，硝酸银、巴比妥钠、硫酸镁 (北京化工厂)，氯化钙 (北京红星化工厂)，硫代硫酸钠 (西安化学试剂厂)。荧光素标记小鼠抗人单克隆抗体 (CD34、CD45、CD44、CD106、CD166) 以及阴性对照抗体 (美国BD公司)。

　　CO2恒温培养箱 (BB16/BB5060 Heraeus，德国)，超净工作台 (北京昌平长城空气净化工程公司)，倒置相差显微镜 (Nikon 801808，日本)，正置显微镜 (Nikon E600，日本)，流式细胞仪 (美国BD公司)。

　　1.2 复苏hMSC-TERT细胞系第30代 液氮中取出冻存细胞，39 ℃水浴快速融解，离心1 000 rpm/min × 10 min，弃上清，用完全培养液 (15% FCS的α-MEM) 重悬细胞，接种于25 cm2培养瓶。

　　1.3 细胞表面抗原检测 采用直接免疫荧光染色流式细胞术测定hMSC-TERT表面抗原 (CD34、CD45、CD44、CD106、CD166)。

　　1.4 诱导hMSC-TERT向脂肪细胞分化 将第30代的hMSC-TERT以3 × 103/cm2接种于6孔板中，每孔内置2个高压灭菌盖玻片。分别各取2个6孔板作为实验组，2个6孔板作为对照组。48 h后，实验组更换诱导液 (含1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/LIBMX、10mg/ml牛胰岛素、100 μmol/L消炎痛、10% FCS的α-MEM) 进行脂肪细胞诱导。每隔3 d换液。对照组更换常规培养液。诱导2周、3周后各取12个玻片行油红O染色。先取细胞爬片用PBS漂洗3次;10%中性甲醛固定10 min;PBS漂洗3次，油红O染液中浸染20 min;PBS漂洗4次;Mayer苏木素 (离心5 min去杂质) 复染8 min，PBS洗4次;湿片甘油明胶封片。光镜观察，随机取10个非重叠视野，计算脂肪细胞占总细胞数的比例，结果用均数 ± 标准差表示。油红O染液的配制：油红O干粉0.5 g加入100 ml异丙醇 (分析纯) 中，密封，置于37 ℃水浴加温，使其充分溶解，干液可长期室温保存。干液与三蒸水以3∶2比例混合，混匀后离心1 200 rpm/min × 5 min，取上清作为新鲜染液。

　　1.5 诱导hTERT-MSCs向成骨细胞分化 将第30代的hMSC-TERT以3 × 103/cm2接种于6孔板中。分别各取2个6孔板作为实验组，2个6孔板作为对照组。24 h后，实验组12孔更换含成骨添加剂 (0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L抗坏血酸磷酸盐) 及10%FCS的α-MEM进行成骨细胞诱导，每3 d换液1次。对照组12孔加常规培养液。于第21天取出细胞爬片，PBS漂洗后，用体积分数为95%的乙醇固定20 min，行钙钴法碱性磷酸酶染色，水洗，系列脱水、透明、封片后显微镜下观察。随机取10个非重叠视野，计算成骨细胞占总细胞数的比例，结果用均数±标准差表示。von Kossa染色：10%中性甲醛固定30 min，蒸馏水漂洗3次，加入1.0% 硝酸银溶液，紫外线照射1 h，蒸馏水漂洗3次，加入5.0% 硫代硫酸钠溶液浸泡2 min，蒸馏水漂洗3次，1%中性红复染10 min，显微镜下观察。

　　2 结果

　　2.1 hMSC-TERT与普通人hMSC形态比较  普通人hMSC为长梭形;hMSC-TERT为短梭形、鳞片状或多角形，较普通人hMSC短。

　　2.2 hMSC-TERT细胞表面抗原检测hMSC-TERT表面抗原CD34、CD44、CD45、CD106、CD166表达均为阴性。

　　2.3 hMSC-TERT向脂肪细胞的分化油红O染色、苏木素复染核后，镜下观察可见胞质内脂滴为橙红色，胞核为蓝色。hMSC-TERT诱导后可见细胞内出现大小不等的脂肪滴，说明已被诱导为脂肪细胞。随着诱导时间延长，含脂滴细胞逐渐增多，胞内小脂滴逐渐聚集成大脂滴。计数结果显示：(78.4 ± 8.2) %的细胞诱导为脂肪细胞，由原来的短梭形变为圆形或多角形，细胞体积增大;部分细胞形态仍为梭形，体积反而逐渐缩小或无变化。未加入脂肪诱导剂的hMSC-TERT行油红O染色后未见细胞内有脂肪颗粒。

　　2.4 hMSC-TERT向成骨细胞的分化 hMSC-TERT被诱导后变为多角形，细胞逐渐向多中心聚拢，形成矿化结节。改良钙钴法碱性磷酸酶染色示实验组胞质呈棕褐色，可见黑褐色颗粒，部分细胞胞质内充满致密黑色沉淀，阳性细胞数为 (82 ± 7.3) % 。von Kossa染色示细胞间出现黑褐色致密圆形矿化结节，大小不均，周围有细胞聚集。以上结果证明：hMSC-TERT已被诱导为成骨细胞。对照组细胞染色后仅少数细胞胞质内有浅褐色颗粒，von Kossa染色未见钙化结节。

　　3 讨论

　　骨髓基质细胞 (MSC) 已被尝试用于修复全身各种器官组织损伤。在神经科学领域动物移植实验中也发现：MSC不但可以促进中枢神经系统损伤修复，而且可以用来治疗神经变性疾病[2]及脑肿瘤[3];其机制如下：①促进各种神经生长因子分泌[4];②促进内源性神经干细胞的增殖分化[5];③促进新生血管生成[6];④减少星形细胞凋亡[7];⑤促进脑血流量及受损血脑屏障恢复[8]。

　　但是，hMSC在体外培养过程中很快就出现衰老及增殖停止，无法进行大量扩增。使用普通hMSC静脉移植治疗大鼠脑损伤要求细胞为3～5代，大鼠体质量为270~300 g，每次有效细胞数约2 × 106[9]，按体质量比计算，成年人体质量平均为50~70 kg，每次移植至少需要约350 × 106个细胞;而从健康成年人抽取15~16 ml骨髓，提取hMSC，体外扩增40 d并传4代才能获得约50 × 106~70 × 106个细胞[10]，远远无法达到进行一次移植治疗所需要的用量。为此，研究者尝试把hTERT基因转入hMSC以提高其增殖寿命和活力，结果发现：hMSC转入hTERT后，不但能在体外长期传代过程中保持增殖能力，从而大量扩增，而且能够保留hMSC的功能和多向分化潜能[11，12]。这一异位表达hTERT的hMSC被称为永生化人骨髓基质细胞 (hMSC-TERT)。

　　迄今为止，对hMSC-TERT的跟踪研究最长期及系统的两个研究组是：①丹麦Kassem工作组：将hMSC-hTERT细胞系体外传代培养3年，发现hMSC-hTERT依然保留自我更新及多向分化潜能等干细胞特征;部分hMSC-TERT随着传代次数增多，增殖速度越来越快，倍增时间不断缩短，且细胞形态发生变化，从早期的鳞片状演变为纺锤形、多角形、立方形;部分hMSC-TERT的增殖速度和细胞形态在长期传代过程中则没有发生任何变化[13]。②日本Hamada工作组：于2003年合成了hMSC-TERT细胞系，该细胞系的形态、倍增时间及细胞表面抗原表达与原代hMSCs一致，核型正常，具有成骨、脂肪、软骨、基质细胞、神经细胞多向分化潜能，培养1年后依然保持增殖活力[14]。

　　我们在研究中发现：本所hMSC-TERT细胞系能够诱导分化为神经元样细胞[1]、脂肪细胞及成骨细胞，并具有良好的增殖活力，同样保留了hMSC的干细胞特征，说明hTERT异位表达及端粒酶活性提高有助于hMSC长期维持成体干细胞的特性[13];hMSC-TERT细胞形态为短梭形或多角形，细胞体积较普通MSC小，倍增时间较普通MSC短。以上特点均与国外文献报道一致。但本研究细胞表型测定结果显示：本所hMSC-TERT细胞系造血干细胞表面抗原标志CD14、CD34、CD45依然为阴性，与转入TERT基因前一致;CD44亦为阴性，而转入TERT基因前CD44表达为阳性[1]，说明转入TERT后细胞表面某些抗原的表达发生了变化，这与国外文献报道不同[14]。考虑到CD44、CD166、CD106均为细胞表面黏附分子，我们又检测了CD166、CD106的表达情况，同样均为阴性。此外，也有其他文献报道转入TERT后hMSC细胞的形态变化及其他各种生物学特性并非一致[13，14]。我们分析，以上差异可能与转入基因插入位点的随机性有关，某些插入部位可能会导致细胞的基因表达出现变化。这一推测仍有待进一步研究证实。

　　hMSC-TERT体外能够大量扩增，清除了细胞数目不足这一关键技术障碍，目前已被尝试用于骨缺损修复[11，12]、造血支持[14-16]和脑损伤修复[17]。同样，hMSC-TERT也可以为MSC的性质研究提供帮助：①hMSC-TERT体外可以长期传代增殖并保留干细胞特征，为hMSC研究提供源源不断的细胞来源，避免反复取材、分离。②hMSC本身是一个异质的细胞群。hMSC-TERT的增殖活力使其可以从单个细胞克隆出大量细胞，从而使从单细胞水平深入研究hMSC成为可能[16，18]。但我们在实验工作中发现：本所部分hMSC-TERT丧失了细胞间的接触抑制。Kassem工作组在对hMSC-TERT细胞的长期观察过程中也发现：部分hMSC-TERT细胞随着传代次数增多，出现接触抑制丧失、锚着非依赖性等肿瘤细胞特征，并在免疫缺陷鼠皮下形成肿瘤 (内有平滑肌和成骨细胞等中胚层成分)[19]。与此相反，部分hMSC-TERT细胞同样长期传代，却仍保持正常hMSC的生物学特性[13，19]，说明如何对hMSC-TERT进行质量控制，是获得足够数量生物学性质稳定的hMSC-TERT，并用于进行组织修复治疗的关键所在。

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