葛根素对血管性痴呆大鼠海马中低氧诱导因子

　　作者：吴海琴，张 蓓，张桂莲，展淑琴，张茹，赵英贤 　(西安交通大学医学院第二附属医院神经内科，陕西西安 710004)

　　摘要：目的 观察葛根素对血管性痴呆(VD)大鼠海马中低氧诱导因子1α和红细胞生成素表达的影响并探讨其可能机制。方法 采用大鼠双侧颈总动脉永久性阻断法(2VO)建立VD的动物模型，SD大鼠随机分为假手术组、2VO组和葛根素组，每组又分为1周、3周、6周、2月(n=6)四个时间点;应用Y型水迷宫实验测定动物的学习记忆能力，采用免疫组化法检测大鼠海马CA1区HIF1α和EPO蛋白的表达。结果 ①2VO组和葛根素组大鼠游全程时间和误入盲端次数均显著增加，但各时间点葛根素组大鼠的学习记忆成绩均显著优于2VO组。②各时间点，2VO组和葛根素组大鼠海马CA1区HIF1α和EPO的表达均较假手术组明显增高，但葛根素组两种蛋白的表达均较2VO组明显降低。结论 葛根素可提高缺血脑组织细胞内氧浓度，改善学习记忆功能，对VD具有确切的保护作用。

　　关键词：葛根素;血管性痴呆;低氧诱导因子1α;促红细胞生成素

　　Effects of puerarin on the expression of hypoxia inducible factor1α

　　and erythropoietin in the hippocampus of vascular dementia ratsWu Haiqin, Zhang Bei, Zhang Guilian, Zhan Shuqin, Zhang Ru, Zhao Yingxian

　　(Department of Neurology, Second Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective To observe the effects of puerarin on the expression of hypoxia inducible factor1αand erythropoietin in the hippocampus of vascular dementia rats and to investigate its possible mechanisms. Methods Rats of experimental group were treated with a permanent bilateral common carotid arteries (CCA) occlusion (2VO) to establish vascular dementia model. Male SD rats were randomly divided into three groups: shamoperated group, 2VO group and puerarin group(twentyfour rats in each group). Rats were evaluated on learningmemory ability by Ytype water maze test. At corresponding time points at 1w, 3w, 6w and 2mon, the dynamic expression of HIF1α and EPO in CA1 region of hippocampus was determined by immunohistochemical method. Results ① The swimming time and error times of rats in 2VO group and puerarin group were significantly increased; but at all time points the rats in puerarin group showed better performance than those in 2VO group. ② Both in 2VO group and puerarin group, the number of HIF1α and EPO positive cells in hippocampal CA1 region were much more than that in shamoperated group; but the expression of HIF1α and EPO at each point in puerarin group was distinctly less than that in 2VO group. Conclusion Puerarin can increase the intracellular oxygen concentration and improve learningmemory ability during cerebral ischemia, and it has definitely protective effects on VD.

　　KEY WORDS: puerarin; vascular dementia; hypoxiainducible factor1α; erythropoietin

　　葛根素是从中药葛根中提取的主要有效成分之一，是一种异黄酮类化合物，具有明确的扩张血管、改善微循环的作用，已被广泛应用于心脑血管疾病的治疗。低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor1, HIF1)是低氧应答时诱导基因表达和恢复细胞内环境稳定的一个核心调节因子。红细胞生成素(erythropoietin, EPO)编码基因是HIF1下游40余种靶基因之一。葛根素对HIF1α和EPO在血管性痴呆(vascular dementia, VD)发生发展过程中表达的影响及其是否通过HIF1/EPO信号转导途径发挥对VD的保护作用尚未见报道。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组 健康、雄性SD(SpragueDawley)大鼠72只，体重(280±20)g，鼠龄2-3月(由西安交通大学医学院实验动物中心提供)。经Y型水迷宫实验筛选后，随机平均分为三大组：假手术组、2VO组和葛根素组，每组再根据缺血时间[血管分离暴露(阻断)至开胸灌注的时间]随机分为4个小组(每小组6只)：①1周组;②3周组;③6周组;④2月组。

　　1.2 主要试剂 葛根素注射液为陕西安康制药厂生产;HIF1α兔抗大鼠亲合纯化抗体来自武汉博士德生物工程有限公司;EPO兔抗大鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;SP试剂盒、DAB显色试剂盒来自北京中山生物技术有限公司。

　　1.3 模型的建立 VD动物模型的制作参照de la Torre等采用的双侧颈总动脉永久性阻断法(2VO)进行。0.67mol/L水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉，大鼠取颈前部正中切口，钝性分离双侧颈总动脉(common carotid arteries, CCA)，套以1号手术线双重结扎，逐层缝合。手术期间严密观察呼吸变化，保证有自主呼吸。假手术组动物仅分离暴露双侧CCA而不结扎;葛根素组于术前3d至术后1周，每天给予葛根素注射液100mg/kg腹腔注射，手术当天于结扎前1h给药;痴呆组于相同的时间分别给予等量0.16mol/L氯化钠溶液腹腔注射。

　　1.4 学习记忆的测定 应用Y型水迷宫实验进行大鼠学习记忆能力的评估。Y型水迷宫装置分为一个长臂(长50cm)和两个短臂(长40cm)，各臂高45cm，宽30cm，长臂为起始区，其中一个短臂为迷路区(盲端)，上覆有不透明塑料板，形成暗道，另一短臂为安全区，装有平台(30cm×10cm)，上方有灯光照明。以大鼠自迷宫起始区游至终点安全台所需时间和途中进入盲端的错误次数，作为衡量学习、获得巩固记忆能力的指标。每只大鼠于测试当天共游迷宫10次，测定学习成绩;24h后重复上述过程测定记忆成绩。实验前先行水迷宫实验，淘汰游泳能力差或智力低下(以游全程时间大于平均成绩的3倍以上即t≥25s作为界点)的大鼠;术后1周、3周、6周、2月的各时间点的大鼠均于处死前再次行Y型水迷宫实验测定学习记忆成绩。

　　1.5 标本的采集 双侧CCA分离暴露(结扎)后1周、3周、6周、2月的各时间点，再次麻醉大鼠，开胸灌注，断头取脑，取前囟后3mm至上丘平面间包含海马的脑组织块，1.39mol/L多聚甲醛固定、石蜡包埋。

　　1.6 免疫组化染色(SP法)及结果判定 将所取之脑块自前向后行冠状切片，片厚3μm，梯度乙醇脱蜡至水，3%(体积分数)H2O2室温孵育40min，微波抗原修复10min，室温冷却2h，正常血清封闭40min，分别滴加第一抗体(兔抗大鼠HIF1α亲合纯化抗体，工作浓度为1∶200;兔抗大鼠EPO单克隆抗体，工作浓度为1∶200)，4℃过夜，生物素化二抗室温孵育40min，加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液室温孵育30min，DAB显色5min，苏木素复染核，脱水、透明、封片。TBS缓冲液分别代替一抗经上述步骤染色作空白对照。取假手术组、2VO组和葛根素组各时间点两指标(HIF1α和EPO)分别经SP染色所得的切片各6张，光学显微镜下观察大鼠海马和大脑皮层的神经细胞，以胞质或胞核内出现鲜艳的棕黄色颗粒的有核细胞为阳性细胞，每张切片高倍镜(10×40倍)下随机选择5个不同的视野(均取自海马CA1区)，计数每个视野中1mm×1mm面积中阳性细胞数，取其平均值。

　　1.7 统计学处理 实验数据用SPSS 12. 0统计软件进行分析，所有数据以均值±标准差表示，组间比较采用方差分析和t检验法，并应用Correlate进行相关性分析，取P<0.05为显著性标准。

　　2 结 果

　　2.1 VD模型制备情况 2VO组死亡4只，葛根素组死亡2只(1只大鼠因术中损伤迷走神经迅速死于呼吸衰竭)，术后24h内，大鼠出现四肢抽搐、翻滚、扭转痉挛后呼吸停止死亡，以上大鼠不列入统计，另随机选取大鼠补齐;假手术组大鼠无死亡。结扎后发现大多数大鼠眼睑下垂，起初兴奋不安，可有共济失调，随后肢体功能活动逐渐恢复，无明显运动障碍，但自发活动减少，行动迟缓，性格执拗。葛根素组大鼠上述变化较痴呆组明显改善。假手术组大鼠较术前无明显变化。

　　2VO组和葛根素每只大鼠断头取脑时均再次检查双侧CCA结扎情况，若无丝线滑脱、松解(实验中发现所有大鼠双侧CCA均结扎完好，造成了有效的脑缺血)，而且其学习记忆成绩相对于同时间点假手术组大鼠明显降低(P<0.05)，则认为造模成功。

　　2.2 学习记忆能力检测 游全程所用时间越长，误入暗道的错误次数越多，说明其学习记忆保持能力越差，提示学习记忆受损越重。缺血1周时，假手术组、2VO组和葛根素组三组大鼠的学习记忆成绩均无明显差异(P>0.05);缺血3周、6周、2月时，与假手术组相比，2VO组和葛根素组的大鼠学习记忆成绩均明显下降(P<0.05)，但葛根素组各时间点学习记忆成绩均较2VO组有明显提高(P<0.05，表1、表2)。表1 不同实验组大鼠的学习成绩(略)表2 不同实验组大鼠的记忆成绩(略)

　　2.3 HIF1α和EPO的表达 2VO组和葛根素组各时间点、各大鼠海马和大脑皮层均可见不同数量的HIF1α表达，以缺血1周时最明显，此后缓慢下降，但仍处于较高水平，主要是海马和皮层的锥体细胞，血管内皮亦有明显HIF1α阳性细胞分布，胞浆、胞核均有明显着色(图1、图2)。EPO亦于相应时间点明显表达于2VO组和葛根素组大鼠的海马各区和大脑皮层，其蛋白表达随时间变化的规律与HIF1α大致相同(图3)，而且在2VO组和葛根素组，HIF1α和EPO两蛋白的表达在P=0.01水平上呈显著正相关(r2VO=0.953，rPu=0.931)。除神经元外，EPO还大量表达于星形胶质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞，主要是胞浆表达(图4)。假手术组HIF1α和EPO阳性细胞偶见(图5、图6);葛根素组各时间点两蛋白的表达与2VO组相比明显减少(表3、表4)。图1 2VO组1周时海马CA1区HIF1α的表达(略)图2 2VO组HIF1α在血管内皮细胞的表达(略)

　　图3 2VO组1周时海马CA1区EPO的表达(略)图4 2VO组EPO在室管膜细胞的表达(略)

　　图5 假手术组1周时海马CA1区HIF1α的表达(略)图6 假手术组1周时海马CA1区EPO的表达(略)表3 不同实验组大鼠海马CA1区HIF1α的阳性细胞数(略)表4 不同实验组大鼠海马CA1区EPO的阳性细胞数(略)

　　2.4 大鼠学习记忆能力与HIF1α、EPO阳性细胞数的关系 2VO组和葛根素组大鼠两蛋白表达与学习记忆能力在P=0.01水平上呈显著相关(表5)。假手术组两蛋白表达与大鼠学习记忆能力均无相关性。表5 HIF1α和EPO的表达与大鼠学习记忆成绩的关系(略)

　　3 讨 论

　　HIF1作为具有转录调控作用的DNA结合性蛋白质因子，对缺氧具有特异感受性。在缺氧条件下，HIF1广泛存在于哺乳动物和人体内，通过作用于靶基因的缺氧反应元件调控相关基因的表达，引起细胞一系列对缺氧的反应，以保持机体的氧稳态，具有重要的病理生理学意义。HIF1是由α和β亚基组成的异二聚体，其中α亚基受低氧诱导表达，是调节HIF1活性的功能亚单位。EPO是一种水溶性、含唾液酸的酸性糖蛋白，除作为造血因子调节和维持血液中红细胞水平外，脑源性EPO还可以通过拮抗兴奋性氨基酸毒性、清除自由基、抗炎症、抗凋亡、提高神经突触传递以及类似神经营养因子样作用发挥神经营养、神经保护作用，有助于新生神经元的产生和缺损功能的修复。实验中发现2VO组大鼠海马CA1区HIF1α和EPO阳性细胞数显著高于假手术组，两种蛋白表达的时间规律和组织分布呈显著一致性，并且2VO组两种蛋白的表达在缺血各时间点与其相应的学习记忆能力在P=0.01水平上呈显著相关，从而表明HIF1α和EPO参与了VD的发生发展过程，并可能通过HIF1/EPO缺氧信号转导途径发挥了保护作用。VD存在的组织、细胞缺氧使HIF1α表达大量增加，激活了转录调节因子HIF1，调节转录其下游靶基因，主要包括：①血管内皮生长因子(vascular endothelial growth fractor, VEGF)及其受体VEGFR;②葡萄糖载体蛋白(glucose trnsporter, GLUT)、腺苷酸激酶(adenylate kinase, AK)和醛缩酶A(aldolaseA, ALDA)、丙酮酸激酶M(pyruvate kinase M, PKM)、乳酸脱氢酶A(lactatedehedrogenaseA, LDHA)等糖酵解酶;③血红素加氧酶(hemeoxygenase1, HO1)、诱导型NO合酶(iducible nitricoxide synthase, iNOS)、内皮素1(endothelin 1, ET1);④P21、P53、Bcl2、Bax[9];⑤胰岛素样生长因子1(insulinlike growing factor 1, IGF1);⑥肾上腺髓质素(Adrenomedullin,AM);⑦EPO等40余种蛋白和酶的编码基因，从而参与调控血管生成、能量代谢、血管舒缩反应、细胞凋亡与增殖、红细胞生成、自由基清除、抗兴奋性氨基酸毒性等诸多病理过程，此过程也是VD发生的可能的神经生化、血管改变、能量转换机制。葛根素，化学名4,7二羟基8βD葡萄糖基异黄酮，是中药葛根的主要有效成分。本研究从造模后动物的自发活动、反应速度等一般行为学情况以及大鼠的学习记忆成绩等方面直接证实了葛根素对VD具有确切的保护作用。实验中还发现葛根素组大鼠海马CA1区HIF1α阳性细胞数显著低于2VO组，由于细胞内氧浓度对HIF1α的表达进行着精细的调节，随着细胞内氧分压的下降，HIF1α的表达呈指数增加，所以葛根素组各时间点HIF1α表达显著低于2VO组。这一结果间接证明了葛根素可以促进缺血脑组织的血流灌注、提高缺血区氧浓度。我们推测其机制可能与葛根素的以下作用有关：①扩张脑血管，增加血流量，改善脑微循环;②抑制血小板聚集;③主要成分为异黄酮，具有雌激素替代效应，抗凋亡，保护神经元;④钙拮抗;⑤清除自由基;⑥拮抗谷氨酸等兴奋性氨基酸对神经细胞的毒性作用;⑦降低血糖;⑧降低血浆血栓素A2/前列环素水平。虽然葛根素组大鼠海马CA1区HIF1α和EPO阳性细胞数介于假手术组和2VO组之间，但也不能排除葛根素可能是通过上调保护性因子HIF1α发挥对VD的保护作用，要进一步明确上述保护作用是否与HIFl/EPO低氧信号转导途径相关还需要进一步研究。

　　本研究从动物行为学和免疫组化阳性物质表达方面证实了葛根素在VD发生发展过程中对缺血神经细胞的保护作用，为临床上葛根素治疗VD提供了有力的依据。葛根素的这一积极作用，也为应用祖国传统医药治疗缺血(缺氧性)脑血管病展示了美好的前景。

　　参考文献：

　　[1]De la Torre JC, Fortin T, Park GA, et al. Chronic cerebrovascular insufficilency induces dementialike deficits in aged rats . Brain Res,1992,582(2):186195.

　　[2]包新民,舒斯云.大鼠脑立体定位图谱 [M]. 北京:人民卫生出版社,1991: 4050.

　　[3]Solaroglu I, Solaroglu A, Kaptanoglu E, et al. Erythropoietin prevents ischemiareperfusion from inducing oxidative damage in fetal rat brain . Childs Nervous System, 2003,19(1):1922.

　　[4]Villa P, Bigini P, Mennini T, et al. Erythropoietin selectively attenuates cytokine production and inflammation in cerebral ischemia by targeting neuronal apoptosis . J Exp Med, 2003,198(6):971975.

　　[5]Lee SM, Nguyen TH, Park MH, et al. EPO receptormediated ERK kinase and NFkappaB activation in erythropoietinpromoted differentiation of astrocytes . Biochem Biophys Res Commun, 2004,320(4):10871095.

　　[6]Liu LX, Lu H, Luo Y, et al. Stabilization of vascular endothelial growth factor mRNA by hypoxia inducible factor 1. Biochem Biophys Res Commun,2002,291(4):908914.

　　[7]Okino ST, Chichester CH, Whitlock JP. Hypoxiainducible mammalian gene expression analyzed in vivo at a TATAdriven promoter and at an initiatordriven promoter . J Biol Chem,1998,273(37):2383723843.

　　[8]Hu J, Discher DJ, Bishopric NH, et al. Hyproxia regulates expression of the endothelin1 gene through aproximal hypoxia inducible factor 1 binding site on the antisense strand . Biochem Biophys Res Commun,1998, 245(3):894899.

　　[9]Fan LF, Diao LM, Chen DJ, et al. Expression of HIF1 alpha and its relationship to apoptosis and proliferation in lung cancer .Cancer,2002,21(3):254

　　258.

　　[10]Palmer LA, Semenza GL, Stoler MH, et al. Hypoxia induces type II NOS gene expression in pulmonary artery endothelial cells via HIF1 . Am J Physiol,1998,274(2 Pt 1):L212219.

　　[11]陈金雄,潘振彬,许清水,等.葛根素治疗椎基底动脉供血不足40例临床研究 . 中西医结合心脑血管病杂志,2005,3(4):359360.

　　[12]姜子恩,李金铭,张志秋.葛根素对周围血管病血栓素A2(TXA2)的影响 . 中国中西医结合外科杂志,2002,8(2):9494.