自噬及凋亡相关蛋白在PC12细胞缺糖缺氧过程中的表达及其意

　　作者：缪春明,张勇,王伟伟,项喜艳,刘菲,康劲　　作者单位：吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春

　　【摘要】 目的 探讨自噬及凋亡相关蛋白在PC12细胞缺糖缺氧(OGD)过程中的表达及其意义。方法 将PC12 细胞分为正常对照组、缺糖缺氧1、4和12 h组。MTT法检测细胞存活率，Western印迹法检测各组PC12细胞中BECN1、Bcl2及Bax蛋白的表达水平。结果 与正常对照组相比，OGD 1及4 h组PC12细胞存活率下降(均P<0.05)，BECN1蛋白表达升高，且Bcl2/Bax比值升高;而与缺糖缺氧1和4 h组相比，OGD 12 h组细胞存活率明显下降(P<0.01)，BECN1蛋白表达及Bcl2/Bax比值亦明显降低。结论 自噬蛋白BECN1及凋亡相关蛋白Bcl2、Bax参与了PC12细胞OGD损伤过程。在OGD早期，自噬起主要作用，并对OGD PC12细胞起一定的保护作用，随着OGD时间的延长，凋亡在其中占主导地位，促进凋亡蛋白表达，引起PC12细胞的死亡。

　　吉林省科技厅资助项目(200705120)

　　【关键词】 自噬;凋亡;缺糖缺氧;PC12;BECN1;Bcl2;Bax

　　细胞缺糖缺氧(oxygenglucose deprivation，OGD)损伤是多种临床上常见的缺血性损伤(如脑缺血、心肌缺血)的病理基础。尤其是脑组织缺血时，由于其高能耗低能储的能量代谢特点，一旦组织缺血、缺氧，神经细胞首先出现能量代谢障碍，引发一系列的细胞结构和功能上的改变导致神经细胞的损伤甚至死亡。目前的研究表明，脑缺血缺氧损伤不但与坏死、凋亡有关，而且还与自噬有关，但自噬在其中的作用还存在争议〔1〕。在细胞培养液中同时去除氧气和葡萄糖，即OGD模型，是体外模拟脑缺血的经典模型。肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞的OGD模型(体外缺血模型)不仅可以模拟整体水平脑缺血的许多病理生理特征，而且由于在体外可以人工严格控制实验条件，在实验过程中可随时观察细胞状态以及药物作用，因而，成为研究缺血性损伤、评价神经保护药物及研究药物机制的一种重要方法〔2〕。本研究利用连二亚硫酸钠(sodium dithionite)消除培养基中的氧同时培养基缺糖建立PC12细胞“缺血”模型，进一步探讨PC12细胞OGD损伤自噬、凋亡相关蛋白表达的分子机制，为临床治疗脑缺血疾病提供治疗靶点。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 连二亚硫酸钠购于国药集团化学试剂有限公司，DAB和MTT购自Sigma公司，抗βactin、BECN1、Bcl2及Bax抗体及相应二抗均购自Santa Cruz公司，BioRad Protein Assay购于BioRad公司，细胞蛋白裂解液购于Beyotime(碧云天生物技术研究所)。PC12细胞由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，IMEM培养基购于Hyclone公司。

　　1.2 PC12 OGD模型的建立及实验分组 PC12细胞用含15%新生小牛血清(Gibco公司)的IMEM培养液，置CO2培养箱(37℃，5% CO2)培养，隔2～3 d传代1次，取对数生长期细胞分组进行实验。根据文献方法〔3〕稍加改进建立OGD模型。将正常IMDM培养液(含15%的新生小牛血清)培养的PC12细胞作为正常对照组;细胞用含2 mmol/L连二亚硫酸钠的无糖Earle液培养的PC12细胞作为模型组，模型组分为缺糖缺氧1、4、12 h组。将培养板置于5% CO2、37℃培养箱中培养相应的时间后观察并测定相关指标。

　　1.3 四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖率 将正常IMDM培养液(含15%的新生小牛血清)培养的PC12细胞用IMDM培养液洗细胞2 次，并稀释至3×105/ml，接种于96孔培养板上，每孔100 μl，作为正常对照组;细胞用含2 mmol/L连二亚硫酸钠的无糖Earle液以同样方法洗涤并稀释至3×105/ml，接种在同一块96孔培养板上，每孔100 μl，作为模型组，模型组分为OGD 1、4、12 h组。实验重复3次，每组实验中相同条件设6个平行孔。细胞活性百分比=实验组OD均值/对照组OD均值×100%。

　　1.4 Western印迹法检测BECN1、Bcl2及Bax蛋白含量 用细胞蛋白裂解液裂解细胞后提取细胞蛋白，BioRad法测定蛋白含量。取蛋白30 μg作SDSPAGE电泳，将蛋白样本转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。转膜后，膜用5%脱脂奶粉封闭1～1.5 h，PBST洗3次，加入抗BECN1、Bcl2及Bax多克隆抗体，4℃过夜。分别加入过氧化物酶标记的相应的二抗，脱色摇床摇1 h，PBST洗3次，每次5 min。DAB显色，凝胶成像系统成像拍照分析。同时以βactin作为内参，实验重复3次。电泳条带密度值=灰度×面积/参照物值。

　　1.5 统计学处理 数据均以x±s表示，用SPSS11.0软件进行多组间ANOVA分析。

　　2 结果

　　2.1 不同时间OGD处理后对PC12细胞的影响 经过1、4、12 h OGD处理，以正常对照组MTT吸光度值为100%，以各模型组吸光度值占对照组的百分比表示存活率。结果显示，与正常对照组相比，OGD组1(70%)及4 h(75%) PC12细胞存活率下降(P<0.05)，12 h(40%)PC12细胞存活率下降更为明显，明显低于1及4 h组(P<0.01)。

　　2.2 PC12 OGD模型BECN1蛋白的表达 Western印迹结果表明：与正常对照组(0.64)相比，PC12细胞OGD 1(0.68)及4 h组(0.69)蛋白BECN1明显升高(P<0.05);随着OGD时间的延长，蛋白BECN1逐渐下降，OGD 12 h组蛋白BECN1(0.50)明显低于1及4 h组(P<0+.01)。

　　　2.3 PC12 OGD模型Bcl2、Bax蛋白表达 Western印迹结果表明，与正常对照组(1.45)相比，PC12细胞OGD1(2.00)及4 h组(1.95)蛋白Bcl2与Bax比值明显升高(P<0.01);随着OGD时间的延长，蛋白Bcl2与Bax比值逐渐下降，OGD 12 h组(1.30)蛋白Bcl2与Bax比值明显低于1及4 h组(P<0.01)。

　　3 讨论

　　自噬是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统，其能清除异常构型的蛋白质，并消化受损和多余的细胞器，对维持细胞的自身稳态有重要意义。在饥饿和新生儿早期，自噬作用明显加强，自噬体显著增多〔4〕;而在新生鼠，如鼠缺失Atg5，自噬过程则不能启动，导致细胞内ATP浓度下降，死于能量缺乏〔5〕。说明在饥饿和新生儿早期，激活的自噬对维持细胞的生存是必需的。Beclinl基因也称BECN1基因，与酵母自噬基因Atg6同源，是介导其他自噬蛋白定位于前自噬小体的关键因子，参与哺乳动物自噬体形成的调控。Beclin1调控自噬的机制主要是与Ⅲ型PI3K形成复合物参与募集胞浆中含FYVE或PX基序的蛋白质，用于自噬体膜的形成，并引导其他自噬蛋白定位于自噬体膜〔6〕。位点244337缺失的Beclin1不能与PI3K结合，无法促进饥饿诱导的自噬作用〔7〕，因此Beclin1是调控自噬的重要基因。

　　细胞凋亡是涉及多基因调控的复杂的主动性程序性死亡过程，其中Bcl2家族蛋白在细胞凋亡的调控过程中具有重要作用，Bcl2和Bax是凋亡调解基因Bcl2家族中两个重要成员。Bcl2和Bax通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡;Bax与Bcl2形成异源二聚体时则实现了Bcl2抑制细胞凋亡的功能〔8〕。Bcl2和Bax调节细胞凋亡，不仅取决于自身表达的高低，而且还与Bcl2/Bax的比值有关，当比值增大时，细胞凋亡增多，反之细胞凋亡受抑制。

　　研究表明，自噬和凋亡存在密切的联系，一方面认为两者是相互促进的，如用甾类物质诱导的果蝇细胞发生进行性细胞死亡时，自噬基因和凋亡基因的表达同时上调〔9〕。一方面认为两者是相互拮抗的，当自噬被阻断时，细胞转向凋亡〔10〕，当凋亡被抑制时，细胞发生自噬性死亡〔11〕。用siRNA干扰Beclin1、Atg5、Atg10、Atg12时，饥饿诱导的细胞凋亡增强，这也说明在营养缺乏时自噬相关基因可能参与凋亡的抑制〔12〕。

　　本研究的MTT结果显示：缺糖缺氧12 h时，PC12细胞存活率下降更为明显，说明随着缺糖缺氧的延长，细胞损伤逐渐加重。Western印迹结果显示：PC12细胞缺糖缺氧的早期BECN1蛋白的表达明显升高，Bcl2与Bax比值亦明显升高，随着缺糖缺氧时间的延长，蛋白BECN1逐渐下降，蛋白Bcl2与BAX比值亦逐渐下降。说明PC12细胞缺糖缺氧能同时激活自噬和凋亡，在缺糖缺氧的早期，主要激活自噬，占主导地位的自噬作为一种保护性机制拮抗凋亡相关蛋白的表达，对细胞的存活起一定的保护作用，但随着缺糖缺氧时间的延长，凋亡逐渐占主导地位，自噬失去其拮抗凋亡作用，从而促进细胞死亡。因此，进一步阐述自噬与凋亡的相互作用或相互转换机制，为临床治疗脑缺血疾病提供治疗靶点具有重要意义。

　　【参考文献】

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　　8 Lalier L，Cartron PF，Juin P,et al.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis〔J〕.Apoptosis，2007;12(5):88796.

　　9 Gorski SM，Chittaranjan S，Pleasance ED,et al.A SAGE approach to discovery of genes involved in autophagic cell death〔J〕.Curr Biol，2003;13:35863.

　　10 Xue L，Fletcher GC，Tolkovsky AM.Autophagy is activated by apoptotic signaling in sympathetic neurons:an alternative mechanism of death execution〔J〕.Mol Cell Neurosci,1999;14:18098.

　　11 Yanagisawa H，Miyashita T，Nakano Y,et al.HSpin1，a transmembrane protein interacting with Bcl2/BclxL,induces a caspaseindependent autophagic cell death〔J〕.Cell Death Differ，2003;10:798807.

　　12 Young AR，Chan EY，Hu XW,et al.Starvation and ULK12dependent cycling of mammalian Atg9 between the TGN and endosomes〔J〕.Cell Sci，2006;119:3888900.