内质网应激及其相关性凋亡与缺血性脑损伤

　　作者：王海英,张秋玲,白波　　作者单位：泰山医学院神经生物学实验室，山东 泰安 271000

　   【关键词】 内质网应激;缺血/再灌注;凋亡

　　1 细胞凋亡与缺血性脑损伤

　　内质网(endoplasmic reticulum，ER)在细胞内分布广泛，是真核细胞中重要的细胞器，其内膜表面积占细胞所有膜结构的50 %，体积占细胞总体积的10 %，参与重要的生理功能的维持，其基本生理功能包括负责蛋白质的合成转运、信号肽识别、糖基化修饰等过程以及钙离子的贮存和调节，信号转导及细胞内钙的再分布。内质网巨大的膜结构为细胞内活性物质的反应提供了一个广阔的平台，在许多信号调控中起到关键作用。最近的研究表明，内质网是细胞凋亡调节中的重要环节[1]。

　　细胞应激涉及线粒体、内质网、细胞核等细胞器的应激，他们既相对独立，又相互作用[2]。内质网是细胞加工蛋白质和贮存Ca2+的主要场所，对应激极为敏感，其功能紊乱时出现错误折叠与未折叠蛋白在腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的状态，称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[3]。ER非常敏感，葡萄糖/营养素缺乏、蛋白质糖基化抑制、二硫键形成障碍、蛋白质转运异常、Ca2+耗竭等刺激都可导致ER功能失调，发生内质网应激。内质网应激主要激活三条信号通路：未折叠蛋白反应(unfold protein response，UPR)、内质网超负荷反应(endoplasmic reticulumoverload response，EOR)和固醇调节级联反应。前两者是由于蛋白质加工紊乱所致，后者则是在ER表面合成的胆固醇损耗所致。

　　凋亡(apoptosis)又叫程序性细胞死亡，是指机体在生理条件下受到刺激后，经过多种信号传递导致细胞产生一系列生态和生化方面的改变而引起细胞程序性死亡的过程。自1972年John Korr第一次提出凋亡概念后，经三十多年的研究，目前已知有三条主要的细胞内信号转导通路来调控细胞凋亡:(1)线粒体通路;(2)死亡受体通路;(3)内质网通路。传统的观点认为，线粒体受损后能释放多种促凋亡物质，从而导致细胞凋亡。最近的研究表明，脑缺血后损伤内质网，导致内质网应激，最终通过多种途径致使神经元凋亡[4]。

　　脑血管病是危害人类生命和健康的常见病和多发病，其中缺血性脑中风占75 %—85 %。有关缺血性脑损伤的基础研究和临床治疗方面均取得很大进展。新近研究证实，在缺血半暗区确实发现有凋亡细胞和神经细胞再生。与急性缺血性神经元坏死相比，半暗区的侧枝循环尚未完全中断，因此，缺血性中风的治疗关键在于延长治疗时间窗和及时挽救缺血半暗带尚未死亡的神经元[5]。缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)时，缺氧、酸中毒、ATP耗竭、钙超载及大量自由基生成等均可作为诱导ERS的刺激因素，ERS在I/R损伤的发生发展中具有重要意义[6]。

　　2 脑缺血诱导的内质网应激及其引发的细胞凋亡

　　2.1 脑缺血后Ca2+浓度变化对内质网的影响及其引起的细胞凋亡

　　Paschen等发现，细胞在短暂性脑缺血时的变化与神经元内质网Ca2+稳态受到破坏后，都出现了内质网应激，显示内质网Ca2+稳态紊乱参与了缺血性脑损伤的病理生理学过程，内质网应激可能是脑缺血细胞损伤的关键环节[8]。

　　细胞内游离钙浓度的变化参与细胞内绝大多数信号传导，调节大部分的细胞功能。内质网是细胞内巨大的钙库，正常情况下，内质网内Ca2+浓度为0.1～1 mmol/L[11]。研究证明，多种刺激因素可以引起内质网内钙离子的动态变化，继而引发迅速或持久的改变，决定细胞的命运。一般情况下，内质网的Ca2+浓度主要依靠3种受体通道调节：内质网内吸收Ca2+钙泵，起释放Ca2+作用的莱恩素受体(ryanodine receptor，RyR)和三磷酸肌醇受体(IP3 receptor，IP3R)通道。内质网腔内的Ca2+主要发挥2种作用：一是释入胞质作为第二信使;二是在内质网腔内调节蛋白酶活性[12]。

　　脑缺血很容易造成内质网损伤，尤其是在再灌注损伤时。在缺血区，由于神经元缺少氧气和能量，引起跨膜离子浓度失衡，细胞膜去极化导致电压依赖性钙通道开放，突触前兴奋性氨基酸释放，其与突触后相应的受体结合后导致细胞外Ca2+内流;此外，缺氧产生的一氧化氮(NO)等也可使内质网中Ca2+释放。内质网Ca2+的释放在大量细胞凋亡实验中被证实[13]。内质网的钙释放参与Bad和Caspase 在不同诱因凋亡中的激活;三磷酸肌醇介导的Ca2+释放与凋亡直接相关。破坏内质网内Ca2+的稳态可以导致内质网应激，包括内质网超负荷反应以激活转录因子NFκB为主要特点，启动多种前炎性蛋白和细胞黏附分子的转录表达，对凋亡进行调控[14]。此外，内质网是完成蛋白质四级结构折叠形成的部位，在内质网内存在着多种相关的酶系统，实验证实，这些蛋白质中的大部分功能与Ca2+浓度的动态变化密切相关。因此，内质网内Ca2+稳态的改变可作用于内质网功能的多个环节，引发细胞凋亡[15]。

　　2.2 未折叠蛋白反应

　　蛋白质在内质网内的正确折叠需要许多分子伴侣蛋白协助，包括Bip/Grp78(immunoglobulin binding protein78)和Grp94(glucoseregulated protein94)及折叠酶类如蛋白二硫异构酶和肽基脯氨酰逆转录异构酶。当内质网中未折叠或错误折叠的蛋白增多时，应激信号通过内质网膜传递到细胞核中，继而引起一系列特定的靶基因转录和蛋白质翻译水平下调， 以利于内质网蛋白折叠形成，使细胞继续存活，这种反应就是未折叠蛋白反应(UPR)[16]。

　　真核细胞有三种不同的机制处理内质网非折叠蛋白沉积:内质网伴侣蛋白基因转录的上调;蛋白质翻译减少;非折叠蛋白由内质网移入胞浆并被降解[17]。非折叠蛋白反应是细胞对抗内质网应激的自身保护机制，即使在正常生长状况下，新合成蛋白的非折叠和错误折叠也可发生，在真核细胞，它可发生于不同的亚细胞结构，如胞浆、线粒体和过氧化物酶体，发生于内质网可引起细胞的病理状态[18]。

　　内质网应激除了对Ire1α(inositol requiring enzymelα)和Ire1β(inositol requiring enzymelβ)的影响，内质网应激也激活另外两个内质网穿膜蛋白:RNA激活蛋白激酶的内质网类似激酶(PKR like ER kinase,PERK)和激活作用转录因子(activating transcription factor6, ATF6)。IRE1和PERK是内质网膜上的跨膜蛋白激酶， 在没有应激情况下，和Grp78/Bip形成稳定的复合物，而当蛋白错误折叠或未折叠蛋白增多时促使Grp78/Bip与其解离，然后IRE1和PERK的寡聚化及其自身磷酸化，刺激下游信号的激活。免疫荧光染色显示,BiP上调的缺血神经元呈现TUNEL染色阳性,提示IRE1介导的信号转导可能与缺血后神经元损伤有关[19]。PERK是惟一在脑缺血后被激活的真核细胞翻译起始因子2α激酶(eukaryotic initiation factor 2 alpha,eIF2α),严重脑缺血后内质网中未折叠蛋白显著增加。IRE1具有核酸内切酶功能，当被激活后能剪接无翻译活性的XBP1mRNA，并编码bZip转录因子，刺激内质网伴侣蛋白的基因转录。PERK的激活导致真核翻译因子(eIF2α)的磷酸化并终止翻译或阻止新合成的蛋白持续进入内质网。ATF6是含有bZip转录因子结构域的Ⅱ型跨膜蛋白，在非内质网应激状态下ATF6主要以酶原形式(P90ATF6)存在于内质网。活化后其胞浆区域可移位到细胞核，起亮氨酸拉链转录因子的作用[20]。当未折叠蛋白在内质网聚集增多时，ATF6向高尔基体转位，被S1P(site21protease)和S2P酶切成p50bZip转录因子到细胞核，并激活XBPI转录增加，导致UPR的活化。ATF6引起内质网应激元件基因启动子区域激活，这些基因包括提高蛋白在内质网腔折叠的蛋白，如Bip/Grp78和钙网膜蛋白等伴侣蛋白及CHOP/GADD153(生长停滞及DNA损伤基因，gene for growth arrest andDNA damage)。CHOP由内质网应激诱导并在生长停止和细胞死亡中起作用，Ire1α和Ire1β，ATF6及PERK的活化均可对CHOP产生诱导，CHOP的激活是内质网应激反应的直接结果。CHOP/GADD153可降低Bcl2表达，使细胞谷胱甘肽耗竭引起细胞凋亡，但CHOP下游的级联尚未证实[21]。以往的研究主要集中在内质网应激时三种跨膜蛋白各自独立的作用，很少研究它们在内质网应激时信号激活的相互关系。

　　Ire1α同源物Ire1β具有核糖核酸酶活性，能切割28S rRNA，抑制蛋白翻译。Ire1α/Ire1β基因双敲除的细胞仍可发生穿过内质网膜的信号传导，表明在哺乳动物细胞内质网伴侣蛋白转录的调节涉及多条信号途径。DuRose等揭示了三种跨膜蛋白对不同形式的内质网应激时显示出不同的敏感性，初步探讨了IRE1、PERK、ATF6三种跨膜蛋白在调节信号传递时的不同特征和相互关系，但其确切的机制还需进一步研究[22]。

　　脑缺血再灌注诱导UPR的真正的生物学作用尚需进一步阐明。如前所述,人们已形成这样一种概念:脑缺血再灌注后数小时内，由于PERK介导的eIF2α磷酸化大量增加，诱导神经元出现蛋白合成抑制。研究表明，凋亡机制在迟发性神经元死亡这一病理学过程中起十分重要的作用。短暂性非致死性缺血，即缺血预处理可防止其后严重脑缺血引起的迟发性神经元死亡[23]。

　　2.3 内质网超负荷反应

　　哺乳动物细胞针对内质网应激还可激活内质网超负荷反应(endoplasmic reticulumoverload response，EOR)，当大量膜蛋白在内质网沉积，核因子NFkB被活化，最终产生对前炎性蛋白及干扰素、白介素等细胞因子的诱导[24]。

　　这一反应可能与细胞抗病毒感染的保护有关。许多破坏蛋白折叠的刺激，如衣霉素、钙离子载体等对UPR和EOR都可激活，这两条途径的内质网应激反应有不同也有重叠。EOR因膜蛋白在内质网沉积引起，其通过NFkB的信号传导与UPR通过Grp的信号传导不同。

　　2.4 固醇调节级联反应

　　内质网膜含有固醇调节元件结合蛋白(sterolregulatory element binding protein ，SREBP)和SREBP裂解激活蛋白(SREBP cleavage2 activating protein ，SCAP)。SREBP含SREBP1和SREBP2两种异构体。SREBP在N2端含螺旋2环2螺旋激活结构域，中间有两个跨膜结构域，C2端是调节结构域。SREBP通过两个跨膜结构域锚定在内质网上，当膜上胆固醇水平升高时，SREBP和SCAP结构形成复合物而抑制胆固醇的合成。当胆固醇耗竭时，SREBP2SCAP复合物被释放并转移到高尔基体而被S1P酶切(S2P可能参与)，成为活性因子易位到胞核而激活靶基因转录[25。

　　2.5 脑缺血后由caspase12活化引发的细胞凋亡

　　短暂性脑缺血后引发内质网应激，内质网应激性细胞凋亡不同于受体介导或线粒体介导的一种新的细胞凋亡途径。短暂性脑缺血时caspase12的表达升高。caspase12作为凋亡起始因子发挥了关键作用。凋亡对机体正常发育和组织平衡很重要，但凋亡过多或过少都会引起疾病。caspase是正常细胞程序化死亡和损伤依赖性凋亡的关键介质，在正常细胞作为一种基本成分表达，并与其抑制剂共存，以防意外激活而引起细胞损伤。作为治疗的靶标，caspase12有很好的安全性，因为caspase12基因敲除小鼠模型无明显发育或行为缺陷，肿瘤发生率正常。caspase12可能对正常发育或肿瘤形成并不重要，因此caspase12是较理想的抗凋亡治疗靶标[26]。

　　caspase12敲除实验证实细胞能抵抗内质网应激诱导的凋亡。caspase12位于内质网的胞浆面，以前体形式存在，仅特异地被内质网信号通路水解活化。caspase12酶原激活为caspase12特异地由内质网损伤引起，重组caspase12切割并激活caspase9酶原，活性caspase12需与另外内质网应激分子协同使caspase9激活，活化的caspase9裂解caspase3酶原等效应caspase，效应caspase切割多ADP聚合酶(PARP)和多种其它细胞内的底物，最终导致细胞凋亡。caspase12对caspase9的激活不依赖线粒体凋亡途径成分Apaf1和细胞色素C。caspase12和caspase9的突变及caspase9的肽抑制剂(LEHD.fmk)均可阻断这一凋亡反应。内质网应激触发了一个包caspase12，caspase9，caspase3而非Cytc依赖的特异级联反应。

　　3 内质网与线粒体途径在细胞凋亡中的相互作用

　　内质网除独立参与凋亡调节外，还在多个环节上与其他细胞器(如高尔基体、线粒体、细胞核等)形成功能耦联，其中最主要的是线粒体。线粒体是细胞能量工厂，也是细胞凋亡调控中最重要的结构之一。内质网可在多个水平(Ca2+，Bcl22家族，三磷酸肌醇受体或RyR受体，NO等)和线粒体相关联，共同调控凋亡[27]。

　　钙离子是联系内质网和线粒体功能的关键环节。当内质网应激发生大量钙离子释放时，线粒体由于其膜电势梯度摄取钙离子，而线粒体的钙超载是已知重要的凋亡因素。内质网通过三磷酸肌醇受体或RyR受体介导的钙离子释放，可以增强线粒体的敏感性，导致线粒体膜通透性改变和去极化。而内质网上的Bcl22则抑制钙离子外流，起到保护作用。

　　线粒体的细胞色素c释放激活下游caspase29/3前体，需要有线粒体外因子(Bax，Bak和tBid等)的转位和激活，开放通透转换孔引起细胞器的水肿，膜通透性的改变。目前认为内质网上的Bcl22家族成员可能参与此过程。此外，线粒体释放的细胞色素c转位到内质网，与三磷酸肌醇受体作用，形成正反馈，促使细胞凋亡[28]。

　　4 展 望

　　内质网腔未折叠蛋白增多或钙失衡，引起内质网应激信号产生从而启动细胞自身保护机制如Bip伴侣蛋白基因表达增加、eIF2α的磷酸化等，但如果脑缺血诱导的内质网应激严重且持续时间长，未折叠蛋白反应(UPR)最终会启动细胞凋亡通路，导致神经元死亡。深入研究内质网的功能，对于完善细胞损伤和凋亡理论有非常重要的意义，为临床疾病的研究和治疗提供新的理论依据。对内质网功能的详尽研究将会推动生命科学领域的发展。

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